1. 研究目的与意义、国内外研究现状(文献综述)
1本课题研究意义 烟酸也称作维生素b3,或维生素pp,分子式:c6h5no2,耐热,能升华。
烟酸别名尼古丁酸、抗癞皮病因子。
在人体内还包含其衍生物烟酰胺以及尼古丁酰胺。
2. 研究的基本内容和问题
研究目标:克隆获得粪产碱杆菌(alcaligenes faecalis)中完整的烟酸代谢基因簇并鉴定各代谢基因的生理功能。
研究内容:1.对粪产碱杆菌(alcaligenes faecalis)菌株进行基因组测序,通过与genbank数据库及相关异生物质微生物代谢专业数据库进行比对和数据挖掘,寻找可能与底物代谢相关的基因;2. 通过转座子插入引起随机突变筛选烟酸代谢的缺陷型菌株,从而获得参与烟酸微生物代谢的相关基因;3. 利用blast进行核苷酸序列和蛋白质序列的同源性比较,推测各个基因产物在代谢中可能的生理学功能、作用的底物和代谢的产物,初步鉴定基因的功能。
逐个克隆、表达可能参与烟酸代谢途径的基因并对其进行功能验证,对酶催化反应的产物进行定性、定量分析。
3. 研究的方法与方案
研究方法:基因组测序、dna提取、载体构建与导入。
技术路线:对菌株进行全基因组测序以及比对,确认其可能的功能基因簇,通过pcr扩出这些基因簇,通过酶连转化将该基因导入大肠杆菌dh5α中,再通过双酶切与广宿主载体相连,最后通过三亲结合等方法,确认该菌株对烟酸的降解基因。
可行性分析:本实验室长期从事环境污染物的微生物种质资源筛选、降解途径、降解机理、代谢调控、转座子功能、生物修复机制等方面的研究,积累了丰富的微生物生理学、遗传学、酶学及分子生物学研究方面的经验。
4. 研究创新点
本项目将首次从分子、生化和遗传学水平上阐明烟酸降解的新的支路代谢途径,克隆参与代谢的全部功能基因簇,并结合基因敲除、互补、体外表达、酶活测定等方法鉴定其生理学功能以及在代谢中的作用,纯化代谢途径的关键酶并进行酶学特性研究,分析烟酸微生物代谢途径之间的差异和进化关系,揭示烟酸微生物代谢机制的多样性和进化策略。
研究成果将丰富烟酸微生物代谢的基础理论,并为探索微生物代谢烟酸的代谢机理的多样性、适应性进化策略及绿色转化提供理论基础。
5. 研究计划与进展
2016年9月~2016年10月:查阅各种相关文献,设计实验方案,进行预备实验等准备工作。
2016年10月~2017年1月:确认菌株的降解能力,研究菌株的降解代谢途径。
2017年1月~2017年3月:菌株的降解基因进行功能验证。
