1. 研究目的与意义、国内外研究现状（文献综述）
灵芝(ganodermalucidum(curt.:fr.)p.karst)是一种传统药用真菌，主要分布于中国、韩国、日本、泰国、马来西亚等东方国家及美国西北部、太平洋西海岸、加拿大洛矶山脉等地。
灵芝在中国和其它亚洲国家已有二千多年的使用历史，享有崇高地位。
灵芝是珍贵的药用真菌，三萜类化合物是灵芝的主要化学成分，同时含有大量微量元素和人体必需的氨基酸，有较高的药用价值，被称之为：上上之药，方中妙品 。
2. 研究的基本内容和问题
1、研究目标对导入tor转化子的灵芝菌丝体的生长状况、菌丝形态、ros（活性氧），ca2 （信号）和菌丝内三萜等次生代谢产物含量变化情况进行研究。
2、内容1)配置cym培养基；2)灵芝菌种（wt野生型、ck1、ck2、tori-1、tori-8、tori-12）转接；3)荧光增白剂染色插片，荧光显微镜观察分叉情况；4)ros染色插片，荧光显微镜观察，测量分析荧光照片灰度；5)ca2 染色插片，荧光显微镜观察，测量分析荧光照片灰度；6)不同浓度梯度雷帕霉素培养野生型；7)测量不同浓度雷帕霉素培养后菌丝三萜含量。
3、拟解决的关键问题tor基因对灵芝生长和次级代谢的影响。
3. 研究的方法与方案
1、研究方法 （1）构建灵芝菌丝体TOR沉默转化子：脂质体转化法；（2）菌丝生长状况测定：平板菌落直径测量，比较；（3）菌丝形态观察：菌丝培养基插片培养，荧光增白剂染色插片，荧光显微镜观察菌丝尖端分叉情况，Photoshop统计分析分叉距离；（4）抗氧化性ROS测定：菌丝培养基插片培养，DCFH-DA染液染色插片，荧光显微镜观察拍照，ZEN 2012分析菌丝灰度；（5）Ca2 含量测定：菌丝培养基插片培养，Fluo-3AM染液染色插片，荧光显微镜观察拍照，ZEN 2012分析菌丝灰度；（6）次生代谢产物含量测定：收菌丝，烘箱烘干，研磨成粉末，超声破碎，测定总三萜的含量；（7）培养基加入不同浓度雷帕霉素，构成雷帕霉素梯度处理菌丝。
2、技术路线NCBI比对同源TOR序列→构建TOR基因RNAi→生长状况→菌落直径→菌丝形态→菌丝尖端分叉 →抗氧化性→ROS→Ca2 →次生代谢产物→菌丝内三萜含量Rapamycin浓度梯度处理→生长状况→生长状况 →菌丝形态→菌丝尖端分叉 →抗氧化性→ROS →Ca2 →次生代谢产物→菌丝内三萜含量3、实验方案及可行性分析1)已具有灵芝遗传转化体系，可供参考；2)具有荧光定量PCR仪，可以进行转化子沉默效率筛选； 3)可借用到荧光显微镜对菌丝进行观察；4)实验室具有超声波破碎，可进行胞内物质研究；分光光度计对胞内三萜含量进行定量分析。
4. 研究创新点
利用荧光染色技术以及ZEN等软件对照片灰度进行分析，从而得知转化体ROS抗氧化性和Ca2 含量的变化情况。
5. 研究计划与进展
研究计划1)2015.8-2015.9查阅资料，整理实验思路，学习基本方法2）2015.9-2015.11对灵芝tor转化子菌丝体进行接种、生长量、菌丝形态、抗氧化性、次生代谢产物进行观察和测定。
3）2015.11-2015.12 对雷帕霉素浓度梯度培养条件下灵芝菌丝体的生长量、菌丝形态、抗氧化性、次生代谢产物进行观察和测定。
4）2016.5处理分析实验数据，撰写毕业论文2、预期进展1)灵芝tor转化子菌丝体在生长量、菌丝形态、抗氧化性、次生代谢产物等方面与野生型有显著差异；雷帕霉素浓度梯度培养条件下灵芝菌丝体的生长量、菌丝形态、抗氧化性、次生代谢产物有显著差异。
