1. 研究目的与意义、国内外研究现状（文献综述）
氯代硝基苯酚（chlorinated nitrophenols, cnps）广泛应用于工农业化学品的生产，如杀真菌剂、杀虫剂、染料等 [23]。由于强吸电子基团硝基和氯的存在，cnps化学性质稳定，在环境中半衰期长，不易被降解[3, 17]。cnps对人和动物高毒，部分cnps还有具有致畸、致癌性，其污染主要来源于工业生产中废弃物的不规范排放，对水体、土壤和大气造成严重的污染，严重损害人类以及整个生态系统的安全[2-4]。美国环境保护署(environment protection agency)和欧洲经济共同体（european economic community）也将一部分cnps列为优先控制污染物（priority pollutants）[8, 17]。由此可见，cnps造成的污染早已引起全世界的广泛重视，而cnps污染的治理一直是科研工作者关注的热点问题[10, 15, 27]。
微生物是环境中污染物降解的主力军，利用微生物降解cnps进行原位修复是一种经济的、安全的、有效的和无二次污染的方法[17]，具有广阔的应用前景。微生物编码的酶在cnps的脱毒、降解方面起着关键作用[4, 7]。卤素原子的去除不仅可以增加化合物的可降解性，而且可以降低化合物形成毒性产物的风险[6, 11, 26]。因此，脱氯是cnps去毒化和降解的关键步骤，也是这类化合物研究的热点。
氯代硝基苯类化合物（chlorinated nitroaromatic compounds, cnas）主要分为三大类，分别是氯代硝基苯、氯代硝基苯甲酸和氯代硝基苯酚，其中关于微生物降解研究最多的是氯代硝基苯，而氯代硝基苯酚和氯代硝基苯甲酸的研究比较滞后。氯代硝基苯类化合物（cnas）的微生物降解机制主要有两类。第一大类是脱硝基机制，这方面的研究报道很多，其降解机理也很清楚，主要有两种：⑴硝基还原[5, 18, 28]。常见的有硝基还原为羟胺基的方式，比如菌株comamonas sp. cnb-1在硝基还原酶cnba的作用下将4-氯硝基苯转化为1-羟氨基-4-氯苯，随后在异构酶cnbb作用下生成2-氨基-5-氯苯酚（图1 a）[27]；硝基也可直接被还原为氨基，比如菌株pseudomonas sp. cbs3能将硝基苯类化合物上的硝基直接还原为氨基[24]。但是，有研究报道称硝基在还原酶的作用下产生的亚硝基或者羟胺，其毒性更大[19, 21]。⑵氧化脱硝基[1, 9, 20]。硝基在加氧酶作用下被羟基替换，比如菌株pseudomonas stutzeri zwlr2-1在3组分双加氧酶系统cnbaaabacad作用下，将2-氯硝基苯氧化为3-氯邻苯二酚[16]。另一类是脱氯机制，脱氯是cnas降解的关键步骤[4]，然而研究很少。已报道的脱氯方式有两种：⑴还原脱氯。菌株rhodococcus erythropolis hlpm-1的细胞破碎液能将2-氯-4,6-二硝基苯酚转变为2,4-二硝基苯酚[22]。⑵ 氧化脱氯。菌株acinetobacter sp. rkj12在单加氧酶的作用下将2-氯-4-硝基苯甲酸脱氯并转化为2-羟基-4-硝基苯甲酸[20]。总体而言，cnas的降解研究主要集中在脱硝基的机制上，其分子机制已经很清楚。但是，具有脱氯作用的纯培养微生物很少报道，而且研究主要集中在代谢途径方面，脱氯基因和酶学的研究更少。因此，cnas的微生物脱氯机制亟需更加系统、详细的研究。
2. 研究的基本内容和问题
1、主要研究内容
（1）重组酶的表达和纯化借助pet29a表达载体，在宿主菌e. coli bl21(de3)中表达携带his标签的cnpa，并借助ni-nta resin（novagen）亲和层析柱洗脱并纯化cnpa。
（2）cnpa的酶学特性研究从温度、ph、金属离子、辅因子、化学抑制剂、酶的底物谱以及动力学参数等方面研究cnpa的酶学特性。
3. 研究的方法与方案
实施方案：
1、2,6-dc-4-np及其降解产物的测定 lc-ms检测 样品经过冷冻干燥后加入适量甲醇溶解，用0.22 μm的有机相滤膜过滤后上机检测。仪器，lc-msd-trap-sl（usa）；离子源，electrospray，阴离子模式；lc-ms紫外检测波长250 nm；质量扫描范围50到300 m/z。 gc-ms检测 样品经过冷冻干燥后，加入适量甲醇，剧烈震荡15 min，静置。吸取甲醇，过无水硫酸钠柱，收集流出的甲醇，稀释后待气质联机分析。gc-ms测定条件：色谱柱规格：15 m 0.25 mm 0.25 μm；载气（氦气）：1 mlmin-1；柱温：起始温度50c，保留1 min，以20 cmin-1的速度上升至250c，保留20 min；进样口温度230 c；ei离子源（70 ev）温度250 c。
2、cnpa的重组表达和纯化重组酶的制备和纯化参照萨姆布洛克等著的《分子克隆：实验指南（第三版）》进行改进。将携带cnpa基因的表达载体pet29a导入菌株e. coli bl21(de3)中，构建重组表达菌株。挑取重组表达菌株转接至3 ml的lb液体中，37℃，180 rpm振荡培养过夜。按1%接种量转接至新鲜的100 ml lb液体培养基中，180 rpm，37℃培养约2-3 h后，od600增至约0.6左右，加入iptg至终浓度为1 mm， 16℃低温诱导20 h，离心收集菌体，用pbs洗涤菌体两次，然后用10 ml结合缓冲液（ph 7.8）重悬细胞，冰浴中超声破碎细胞。4℃，12,000g离心10 min去除沉淀，含重组蛋白的上清液通过ni-nta resin（novagen）进行洗脱纯化。纯化步骤如下：1. 取适当体积树脂装柱，静置让其自然沉降；2. 用三倍柱体积milliq水冲洗树脂；3. 用三倍柱体积的结合缓冲液（ph 7.8）平衡，并将结合缓冲液引流到柱顶部；4. 样品上柱；5. 用6个柱体积的结合缓冲液洗柱； 6. 用6个柱体积的洗涤缓冲液（ph 6.0）洗柱；7. 用6个柱体积的含10 mm咪唑的洗涤缓冲液洗柱，收集洗脱下的蛋白；8. 依次用6个柱体积的含30，50，100，150和200 mm咪唑的洗涤缓冲液洗柱，收集洗脱下的蛋白。纯化产物经过sds-page 分析确认无误后用于酶学研究。
4. 研究创新点
目前为止，关于氯代硝基苯类化合物的微生物脱氯研究非常少，其脱氯机制更是缺乏分子水平的系统研究。
本项目中，cnpa能将2,6-二氯-4-硝基苯酚（2,6-dc-4-np）转化为脱氯的中间产物6-氯偏苯三酚，强烈暗示有新的脱氯途径和脱氯机制的存在。
本项目将从基因和酶学水平深入研究，阐明cnpa脱氯降解2,6-dc-4-np的分子机制，丰富氯代硝基苯类化合物的微生物脱氯机制研究，为氯代硝基苯类化合物的脱氯降解和生物修复提供基因和酶资源。
5. 研究计划与进展
2014.7-2014.12
1、cnpa的重组表达和纯化，酶活测定方法的确立；
2、cnpa基因的敲除和互补，研究突变株和互补株的生理和功能上的差别；
