具有矿物风化能力细菌Arthrobacter sp.A33的多项分类研究开题报告

1. 研究目的与意义、国内外研究现状（文献综述）

矿物风化是在地表及其附近发生的重要的地球化学现象之一，是形成土壤的前提（barker et al., 1998）。矿物风化会影响着人类的生活，如地下水的质量、食品安全、重要建筑及文物的保护等方面。微生物广泛分布于各种地质环境中，是矿物风化的重要参与者，其通过改变微环境ph、络合物浓度及氧化还原电位来加速矿物的溶解（burford et al., 2003；liu et al., 2013），并能够影响地球化学环境和地球化学过程。研究微生物对矿物的风化作用有助于深入理解土壤的发生过程、土壤养分供给、全球气候调节等方面具有重要的意义。

微生物对营养的需求可能是其风化矿物的主要驱动力（hutchens，2009）。也就是说，微生物对矿物的风化作用不是简单的新陈代谢的副产物，而是从矿物中获得必需的营养来满足自身生长的需要。微生物可以通过产生有机酸、铁载体、胞外聚合物和生物膜等方式来溶蚀硅酸盐矿物（lian等，2008；盛下放和黄为一，2002；khraisheh等，2005； duckworth等，2009），进而释放出k、si、mg和fe等矿质元素。目前，细菌对矿物的风化作用格外引起了学者们的关注。研究表明（uroz et al., 2011），有大量的来自不同种属的细菌可以定殖在矿物的表面或引起矿物的风化，其中一些菌株还具有促进植物生长的作用。

节杆菌属（arthrobacter）是属于放线菌门的一类革兰氏阳性细菌。在生活史中细胞有显著变化，幼龄菌体完全或大部分是杆状或不规则杆状，老细胞则缩短为球形或类球形。目前，节杆菌属由82株模式种所组成，它们的来源也比较广泛，如土壤、医学或动物临床等环境。有研究表明，节杆菌也是具有矿物风化能力的细菌。frey等（2010）发现arthrobacter属细菌能通过产生hcn和草酸等有机物才风化矿物。本实验室从南京市江宁区小龙山钾长石矿区土壤中分离到一株具有矿物风化能力的细菌a33，初步鉴定其属于arthrobacter，并为该属潜在的细菌新种。本研究通过细菌的形态观察、生理生化特征和16s rrna基因序列等方面的研究初步明确菌株a33的分类地位。该研究将丰富具有矿物风化能力细菌的种质资源库、基因库，并为进一步研究细菌-矿物相互作用提供重要的试验依据。

2. 研究的基本内容和问题

研究目标：通过对arthrobacter sp.a33菌株的多项分类研究证明该菌种为节杆菌属的一个新种并明确其分类地位

研究内容：对arthrobacter sp.a33菌株的多项分类研究，主要包括：

（1） 形态学研究 菌体形态（包括革兰氏染色，观察其芽孢是杆状还是球状，电镜下观察其是否有鞭毛及其形状）菌落形态（边缘形状，隆起或凹陷，是否含有色素，直径是多少）

3. 研究的方法与方案

研究方法：首先通过形态学观察和生长特性的探究对Arthrobacter sp.A33菌株进行系统和具体的观察和探究，以证明其具有节杆菌属共同的特征以及自身具有的特征；在验证Arthrobacter sp.A33菌株是节杆菌属中的一个新种中利用对比试验的方法，将各类研究试验同时应用于本课题选取的节杆菌属的其他五种菌株上，在做常规的生理生化鉴定的同时，使用API系统对其进行对比鉴定；此外，还对试验菌种做16s rDNA序列分析，通过数据和定性试验来证明其确为新种。

技术路线：

实验方案：

(1) 形态学研究: 涂布培养 在显微镜下观察细胞外形大小、形状、排列等，细胞构造，革兰氏染色反应，能否运动、鞭毛着生部位和数目，有无芽孢和荚膜、芽孢的大小和位置。在一定的固体培养基上生长的菌落特征，包括外形、大小、光泽、黏稠度、透明度、边缘、隆起情况、正反面颜色、质地、气味、是否分泌水溶性色素等；在一定的斜面培养基上生长的菌苔特征，包括生长程度、形状、边缘、隆起、颜色等；在半固体培养基上经穿刺接种后的生长情况；在液体培养基中生长情况，包括是否产生菌膜，均匀浑浊还是发生沉淀，有无气泡，培养基的颜色等。

(2) 对环境的适应能力: 分周期和阶段培养 制作不同浓度梯度和各类培养基 做对比试验和重复实验 主要包括：

①温度范围测定 分别将菌种培养到4℃、10℃、15℃、20℃、30℃、37℃、42℃、45℃的环境中，观察其是否生长

②盐浓度测定 分别将菌落培养到NaCl浓度为0-10%浓度梯度下，每1%为一梯度，测其OD值

③pH测定 分别将菌株培养pH为4-10的培养基内，测定其OD值

(1) 生理生化特性将节杆菌属中的其他五种选用的菌株与Arthrobacter sp.A33菌株进行对比试验，采用基础微生物学中的各类研究生理生化特性的实验来观察Arthrobacter sp.A33菌株和其他菌种的相似和不同之处 主要有：

①甲基红试验（MR 试验）

将大肠杆菌和产气杆菌分别接种到葡萄糖蛋白陈水培养基中，37℃ 培养48h ，加甲基红指示剂数滴，观察结果，呈现红色者为阳性，呈现黄色者为阴性。

②伏一普二氏试验（V . P .试验）

将试验菌接种于通用培养基，于361C培养4天、培养液2.5ml先加入5Cα萘酚（2-na-phthol）纯酒精溶液0.6ml,再加40%氢氧化钾水溶液0.2ml，摇动2~5min，阳性菌常立即呈现红色，若无红色出现，静置于室温或361C恒温箱，如2h内仍不显现红色、可判定为阴性。

③吲哚试验

在培养液中加入乙醚1～2ml，经充分振荡使吲哚萃取至乙醚中，静置片刻后乙醚层浮于培养液的上面，此时沿管壁缓慢加入5～10滴吲哚试剂（加入吲哚试剂后切勿摇动试管，以防破坏乙醚层影响结果观察），如有吲哚存在，乙醚层呈现玫瑰红色，此为吲哚试验阳性反应，否则为阴性反应，阳性用＋、阴性用－表示

④硫化氢试验：

将大肠杆菌和变形杆菌以接种针穿刺接种到醋酸铅或柠檬酸铁氨培养基中，37℃培养24h，观察结果，若有黑色出现者为阳性。

⑤明胶液化试验

取纯培养物少许，以接种针分别穿刺接种到营养明胶培养基中，置20℃培养5 -7 天。观察明胶培养基液化情况。若被检细菌20 ℃ 不易生长，可放37 ℃ 培养，但在此温度下明胶培养基呈液状，故观察结果时，应将明胶培养基轻轻放入4℃ 冰箱30min ，此时明胶又凝固。若放置于冰箱30min仍不凝固者，说明明胶被试验细菌液化，是为阳性。

⑥淀粉水解试验

将配制好的淀粉培养基冷却，以无菌操作制成平板。用接种环取少许试验菌株划线接种在平板上，置37OC 温箱培养24h 。将平皿取出，打开皿盖，滴加少量卢戈氏碘液于平板上，轻轻摇动平皿，使碘液均匀铺满整个平板。如菌苔周围有无色透明圈出现，说明淀粉己被水解。透明圈的大小，说明该菌水解淀粉能力的大小。

⑦硝酸盐还原试验

被检菌接种于硝酸盐培养基中，于35℃培养l～4d.将甲、乙液等量混合后（约0.1m1）加入培养基内，立即观察结果。出现红色为阳性。

(1) API鉴定

① API 50 CHB/E 挑取平板上30℃培养36h的菌株，悬浮于1ml蒸馏水中。将此菌悬液滴加到5ml的0.85% NaCl溶液中，使其浊度达到2McFarland，记录滴加的滴数（记为n）；向API 50 CHB培养基中加入2n滴上述菌悬液，混匀；从密封包装中取出API 50 CHB/E试条，置培养盘内，底部加入适量水；用含有菌的API 50 CHB培养基中接种试纸条（仅加满管的部分，管的上部不要加菌悬液）；将试条放在30℃进行孵育，分别在24h和48h判读试条。

② API ZYM 挑取TSA平板上30℃培养36h的菌株，制备菌悬液并使其浊度在McFarland NO.5-NO.6之间；准备培养盘和盖子，装约5ml自来水于培养盘内；从密封的包装中取出API ZYM试条，置培养盘内，用上述菌悬液接种试纸条；37℃培养4h，加入1滴ZYM A试剂和1滴ZYM B试剂，待5 min后生色；如果是阳性，置试纸条于强光源（1000W）下10秒，以消除杯中多余坚牢兰的黄颜色，在置试条于阳光下几分钟后读结果。

(2) 分子鉴定 对Arthrobacter sp.A33菌株的16S rDNA进行提取、扩增和测序并将节杆菌属中的其他五种选用的菌株与试验菌株的16S rDNA序列进行比对，确定其为新种。

可行性分析：验证Arthrobacter sp.A33菌株为新种的各项试验均为常规验证微生物为新种的实验且符合伯杰氏细菌鉴定手册的各项要求；API系统是近年来研究微生物菌种生理生化特性的一种非常可靠而快速简便的方法；明确该菌种的分类地位的各种试验方法均为研究微生物分类地位的很成熟的方法和手段，本课题的实验方案的可行性良好。

4. 研究创新点

发现了一株具有含钾矿物风化能力的细菌新种Arthrobacter sp. A33，并进行了初步的鉴定。

5. 研究计划与进展

本课题由于所用的菌种为进口品种，到本校的时间大约为2月底，所以定于3月开始

时间安排为：3月3日-15日 形态学研究和对环境适应能力探究并为后续试验培养大量菌种做准备

3月16日-31日 生理生化特性研究 生态学研究和api鉴定