1. 研究目的与意义、国内外研究现状（文献综述）
一、研究意义
自1984年先正达公司开发硝磺草酮除草剂以来[1]，因其具有安全性好、杀草广谱、除草活性高、环境兼容性好、毒性低、残留少等优势，被广泛运用于防除田间杂草。硝磺草酮对玉米田中一年生阔叶杂草和部分禾本科杂草防除效果显著[2]，包括苘麻、芥菜、繁缕、苍耳、地肤、藜属杂草、稗草、龙葵和马唐等，同时可以有效防除对磺酰脲类除草剂产生抗性的杂草。硝磺草酮对玉米、农田环境和后茬作物都有良好的安全性，可以替代长期使用并且有较长残留期的莠去津等三氮苯类除草剂[3]。
硝磺草酮是一种对羟苯基丙酮酸加氧酶(4-Hydroxyphenylpyruvate dioxygenase, EC 1. 13. 11. 27，简称HPPD)抑制剂，通过抑制植物体内HPPD活性间接影响植物生长发育，这与酪氨酸在生物体内的代谢过程密切相关[4]。在除革兰氏阳性细菌外大多数生物体内，酪氨酸首先在酪氨酸氨基转移酶(Tyrosine aminotransferase, EC2.6.1.5)的作用下转化为对羟苯基丙酮酸(q-Hydrotyphenylpyruvate, HPP)，然后HPPD催化HPP与O2形成尿黑酸。在微生物体内尿黑酸用于黑色素的生物合成，有利于微生物在某些环境条件下生存。在哺乳动物体内，尿黑酸进行进一步的分解代谢[5]。在植物体内，尿黑酸是生育酚和质体醌生物合成的前体物质，且HPPD是合成生育酚和质体醌的关键酶[6]。
在植物体内类胡萝卜素生物合成的过程中，类囊体内的质体醌是最终的电子受体以及光合链中的电子传递体，因此质体醌的缺乏会导致类胡萝卜素生物合成减少，光合链电子无法正常传递，产生质体的光氧化。在强光条件下，类胡萝卜素含量降低导致植物体过剩能量不能淬灭，会破坏叶绿素分子，因此叶片会出现白化症状，甚至导致植株死亡[7]。生育酚的减少会使杂草内发生脂类过氧化作用，导致杂草坏死。此外，生育酚可以防止光合系统反应中心的D1蛋白降解，维持结构和功能稳定，因此其减少会导致杂草光合作用水平下降，阻碍杂草正常生长[8]。
在植物和哺乳动物体内，虽然硝磺草酮都具有抑制HPPD活性，减少尿黑酸合成的作用，但是其作用效果完全不同。哺乳动物体内，尿黑酸合成被抑制可以减缓酪氨酸代谢缺陷症状[9]，而植物体内尿黑酸的减少影响植物的光合作用。因此，硝磺草酮是一种对哺乳动物安全性较好的田间除草剂。
硝磺草酮作为一种除草剂，虽然在田间使用过程中展现出诸多优势，但具有HPPD抑制剂抗性特征的田间作物种类较少。通过转基因方法，提高植物体内HPPD对硝磺草酮的抗性，可以有效扩大硝磺草酮的使用范围。其中，筛选出硝磺草酮抗性基因是转基因作物培育的基础。微生物突变率高，基因资源丰富，从中筛选出硝磺草酮抗性菌株，克隆得到硝磺草酮抗性基因是一种高效便捷的方法。因此，筛选硝磺草酮抗性菌株并克隆表达其抗性基因具有重要的研究意义。
二、国内外研究概况
目前国内外已有许多关于HPPD抑制剂抗性菌株筛选和抗性基因克隆的研究和专利：徐海英等[10-13]从含HPPD抑制剂异恶唑草酮的试验田土壤样品中分离出抗异恶唑草酮的四种菌株，从中克隆出异恶唑草酮抗性基因，分别在水稻、拟南芥和玉米中转化表达，培育出的转基因作物对异恶唑草酮具有良好的耐受性。从天然样品中筛选得到的hppd基因的表达产物对硝磺草酮等HPPD抑制剂型除草剂的耐受性大多较差，一些专家学者采用定点突变技术对基因进行改良，以达到理想效果。Sailland等[14]发现荧光假单胞菌中HPPD对异噁唑草酮有较低的抗性，然后通过定点突变技术处理其hppd基因，在大肠杆菌中表达，最终筛选出对异噁唑草酮有较高抗性的突变体G336W。朱健康等[15]通过对铜绿假单胞菌中的hppd基因进行定点突变，得到对硝磺草酮具有高抗性的基因PaHPPD-SDM，用该突变体构建的转基因水稻获得了良好的硝磺草酮耐受性。拜耳公司培育出一种新型大豆，对草甘膦和异噁唑草酮有良好的抗性，其中HPPD蛋白由hppdPfW336基因编码[16]。近年来我国发现并申请专利的HPPD抑制剂抗性基因及其应用情况见表1.
表1 HPPD抑制型除草剂的抗性基因及其应用
Table 1 HPPD-inhibiting herbicide resistance genes and their applications
| 基因名称 | 基因来源 | 抗抑制剂类型 | 应用 | 参考文献 |
| Pa-HPPD | 铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa) H-1 | 异恶唑草酮 | 转Pa-HPPD基因的水稻在T1代和T2代对异恶唑草酮均有良好抗性 | [10] |
| Ct2-HPPD | 睾丸酮丛毛单胞菌(Comamonas testosteroni) | 异恶唑草酮 | 转Ct2-HPPD基因的拟南芥能耐受10mM的HPPD抑制剂（75%异恶唑草酮水分散粒剂） | [11] |
| Och-HPPD | 人苍白杆菌 (Ochrobactrum anthropic) H-2 | 异恶唑草酮 | 转Och-HPPD基因的拟南芥、水稻对异恶唑草酮耐受性好，转Och-HPPD基因的玉米对异恶唑草酮的耐受浓度是田间喷洒浓度的5倍 | [12] |
| Pp-HPPD | 恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida) H-6 | 异恶唑草酮 | 转Pp-HPPD基因的水稻、拟南芥和玉米均对异恶唑草酮有良好的耐受性 | [13] |
| PaHPPD- SDM | 铜绿假单胞菌 (Pseudomonas aeruginosa) HPPD突变体 | 硝磺草酮 | 转PaHPPD-SDM基因的盆栽水稻喷施200 μM硝磺草酮后生长良好 | [15] |
| CF48 | 甘蔗 (Sacchrum officinarum) | 硝磺草酮 | 转CF48基因的“秀水134”水稻耐受15mg/m2硝磺草酮 | [17] |
在目前的HPPD抑制剂型除草剂抗性作物的研究中，对hppd基因的相关研究已经发表许多相关专利，近年来硝磺草酮抗性基因成为研究热点，但从微生物中直接获取高抗性基因的报道较少。
三、应用前景
玉米是中国乃至全球最重要的粮食作物，硝磺草酮是玉米田第二大除草剂。此外，硝磺草酮还可以有效防除稻田中的低龄稗草和抗磺酰脲类除草剂的阔叶杂草及莎草等[2]，是一种除草效果好且安全性高的HPPD抑制型除草剂，其生产和使用将进一步增加。目前对于硝磺草酮抗性基因的研究较少，从自然界中获取的硝磺草酮抗性菌株对硝磺草酮的耐受性不高，不能直接用于抗硝磺草酮转基因作物品种的培育。因此，从自然界中筛选分离新型硝磺草酮抗性菌株，可为我国hppd转基因作物的培育提供新的基因资源和基因储备，有利于进一步扩大硝磺草酮的应用。2. 研究的基本内容和问题
一、研究目标
从自然界中筛选分离出对硝磺草酮有高抗性的菌株，并对其抗性基因进行克隆表达。
二、研究内容
3. 研究的方法与方案
一、研究方法
1、 采用涂布平板法和平板划线法筛选并分离硝磺草酮抗性菌株；
2、 采用显微镜观察法从形态学角度观察菌落，采用pcr方法扩增16s rdna并进行序列分析，从分子生物学角度鉴定菌株；
4. 研究创新点
硝磺草酮杀草广谱，除草效果好而且对哺乳动物安全，与其他除草剂混用可达到更好的效果，但耐受硝磺草酮的农作物有限，限制了其使用范围。因此寻找硝磺草酮抗性基因并将其转化到农作物中，是一种扩大硝磺草酮适用范围的有效手段。硝磺草酮是一种HPPD抑制型除草剂，目前已有许多报道和专利与HPPD抑制剂型除草剂抗性基因有关，但其中对硝磺草酮具有抗性的基因较少，且大多经过基因改造而获得，自然条件下获取的硝磺草酮抗性基因对硝磺草酮的耐受性均不理想。微生物在自然界中广泛存在，且因其个体微小、繁殖迅速、突变率高等特点，可方便快速地从中获得所需基因。因此本研究以微生物为材料，从中获取对硝磺草酮具有高抗性的基因并表达，为我国hppd转基因作物的培育提供基因资源与储备，有利于进一步扩大硝磺草酮的运用范围。
5. 研究计划与进展
| 2019.9-2019.10 | 查阅、收集资料，明确具体研究方案； |
| 2019.10-2020.1 | 收集实验材料，筛选并鉴定硝磺草酮抗性菌； |
| 2020.3-2020.4 | hppd基因克隆，进行序列分析； |
| 2020.4-2020.5 | hppd基因功能验证，表达抗性基因并检验硝磺草酮抗性水平； |
| 2020.5-2020.6 | 整理实验数据，撰写论文。 |
