Drosha RBD区域插入序列对miRNA加工功能的影响开题报告

1. 研究目的与意义、国内外研究现状（文献综述）

microrna（mirna）是一类大小在22个核苷酸左右，广泛表达于多细胞生物体内的小分子非编码rnas^[1][2]，其通过与靶基因的mrna 3’端非编码区域(untranslated region, utr）互补序列(mirna-response element, mre)进行碱基互补配对结合，从而从转录或翻译水平上降低靶基因的表达^[1]，参与调控细胞多种生命活动 ，包括干细胞分化、细胞凋亡、衰老、免疫反应等^[6][7][8]，并且与多种人类疾病的发生具有紧密的联系，尤其是癌症的发生^[9][10]。

mirna的细胞内合成开始于细胞核内，经由核内drosha全酶复合物和细胞质dicer蛋白参与进行剪切加工，最终形成成熟的单链mirna ^[3][5]。在加工过程中，drosha的全酶复合物与dicer均是通过其肽链c端存在的rbd（double-stranded rna-binding domain）识别并结合pri-mirna及pre-mirna的^[4]。

rbd又称dsrm，是一个包含约70-75氨基酸，具有保守的αβββα拓扑结构的蛋白质结构域，广泛存在于rna结合蛋白的氨基酸序列中。在mirna的加工中，drosha结合pri-mirna的rbd结构，即drosha-dsrbd，其同样具有一个类似的αβββα拓扑结构^[12]。

2. 研究的基本内容和问题

1 研究目标

构建引入drosha-dsrbd插入序列的dicer合成序列，并且检测具有该插入序列的dicer与pre-mirna结合能力、剪切pre-mirna能力的变化，以探究该rbd插入序列对mirna合成加工的影响。

2 研究内容

3. 研究的方法与方案

1 研究方法及试验方案

1.1 制备突变型dicer

1.1.1 构建载体

4. 研究创新点

本试验针对RNA结合蛋白中普遍存在的RBD序列特异性识别、结合并参与加工RNA的方式及机理展开，在已有研究的基础上，从已有报道的一段存在于人源及果蝇源Drosha-dsRBD区域的特殊插入序列入手，对这一序列在miRNA加工中所起到的作用展开讨论，将其引入同样参与miRNA加工但其RBD结构并不具有该插入序列的Dicer蛋白编码基因中，能够有力地验证该序列是否具有特异性，以及参与RBD区域结合、加工RNAs时发挥作用的机理，为进一步针对RBD结构功能机理的研究提供了可能的理论基础。

5. 研究计划与进展

1 研究计划

1.1 2020年1月至3月：构建drosha-dsrbd及flag蛋白插入载体，转染细胞表达突变型dicer，并进行细胞外检测。

1.2 2020年3月至4月：设置对照组，进行细胞内检测。