1. 研究目的与意义、国内外研究现状(文献综述)
意义:Hippo信号通路是一条调控细胞增殖的关键信号转导途径。这条通路主要通过对Yap蛋白的磷酸化进行调控,控制Yap蛋白的入核,从而调控细胞增殖相关基因的转录。本课题通过鉴定此信号通路中两个关键基因BTRC和FOS的功能,以此为进一步了解Hippo信号通路的主要调控途径和方式打下一定的基础。
国内外研究概况:目前对Hippo 通路本身阐述较为清楚,如核心激酶级联反应链以及下游相关蛋白和基因已有较为明确的认识,但其具体的调控机制还不明确,还有待进一步研究。
2. 研究的基本内容和问题
研究目标和内容:本课题主要研究Hippo通路两个关键基因BTRC/FOS的功能,了解这两个基因对于Hippo信号通路的调控作用及其表达产物的作用机制。
拟解决的关键问题:BTRC和FOS基因的克隆,构建其表达载体并转入真核细胞中表达。
3. 研究的方法与方案
首先,设计BTRC和FOS基因的PCR引物,再得到它们的cDNA后,通过PCR将这两个基因进行克隆。再用pcmv这个质粒载体构建一个表达体系,即用双酶切分别对两目的基因和载体进行酶切,然后将目的基因与载体连接。构建的表达体系再转化感受态大肠杆菌,使其在大肠杆菌中大量扩增以获得较多的连接有目的片段的质粒。之后,通过中量提取质粒,将其转入T细胞进行表达,再裂解细胞得到目的蛋白后,通过IP(免疫共沉淀)技术检测目的蛋白与相关蛋白的相互作用。
实验室已具有相关各种仪器设备和所需细胞,BTRC和FOS基因的引物和cDNA可向相关单位和公司索取,购买即可,所以实验完全可行。
4. 研究创新点
课题中利用IP即免疫共沉淀检测目的蛋白和相关蛋白的相互作用
5. 研究计划与进展
4月10号前可拿到引物和cDNA,4月10号到5月10号即可完成全部的鉴定工作
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