UbiD蛋白的克隆、表达和纯化开题报告

 2022-02-07 17:03:34

1. 研究目的与意义、国内外研究现状(文献综述)

泛醌是原核生物中一种必须的电子载体。在大肠杆菌泛醌的合成包括至少9个反应,ubid可以催化底物3-八异戊烯-4-羟苯酸盐(3-octaprenyl-4-hydroxybenzoate)向2-八异戊烯石碳酸(2-octaprenyl phenol)的转变。大肠杆菌ubid的突变影响泛醌的生物合成,积累4-hydroxy-3-octaprenylbenzoicacid (hp8b),以及使试管中缺少脱羧酸反应。

因此此研究对于了解ubid蛋白在泛醌合成中的具体作用机理很有意义。

国内外研究概况:

ubid相似的序列已经在很多微生物基因组中被发现,反映了泛醌辅助因子和其生物合成的普遍存在。大多数的ubid序列彼此间很相似,基因簇氨基酸相似度在70%到100%之间。

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2. 研究的基本内容和问题

UbiD蛋白催化底物3-八异戊烯-4-羟苯酸盐(3-octaprenyl-4-hydroxybenzoate)向2-八异戊烯石碳酸(2-octaprenyl phenol)转变的机理

关键问题是Ubid蛋白的活性中心

3. 研究的方法与方案

运用聚合酶链式反应,以大肠杆菌(E.coli)基因组DNA为模板,克隆扩增UbiD的全长片段。对质粒和目标片段同时进行双酶切并连接。将连接成功的质粒转移到Top10菌株中,通过抗性筛选选择出转入新质粒的菌并进行小管培养并测序确定目标片段的转入。如果目标片段成功转入则提取质粒并转入BL21菌株中进行目标蛋白表达鉴定和回收。鉴定成功表达的蛋白离心收菌,超声波破碎,随后经过Ni柱以及分子筛等手段对目标蛋白进行纯化,最后结晶。

可行性分析:实验方案所涉及的都是常规蛋白分离纯化的步骤,且与UbiD蛋白相似的蛋白UbiG已经用相似的方法得到结晶,因此该实验方案可行。

4. 研究创新点

关于UbiD蛋白的报道还比较少,在选题方面比较创新

5. 研究计划与进展

2月20--3月初 ubid基因的克隆

3月初--3月底 ubid蛋白的表达和纯化

3月底--4月 蛋白结晶

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