1. 研究目的与意义、国内外研究现状（文献综述）
1.1霍乱与霍乱弧菌
霍乱弧菌是一种革兰氏阴性、兼性厌氧小杆菌，作为引起脱水性腹泻疾病霍乱的病原体，在世界范围内曾引发过多次流行病的爆发。霍乱主要表现为剧烈的呕吐、腹泻和失水，发病急，传播快，危害十分严重，是我国法定报告的甲类传染病和国际检疫传染病中最为严重的一种。革兰氏阴性细菌霍乱弧菌（vibrio cholerae）是引起霍乱的病原细菌，自其在1817年被发现以来曾经引起过七次世界大流行。尽管霍乱弧菌拥有200多个血清型，但是只有o1和o139这两个血清型具有致病性。基于其它的生理学特性，霍乱弧菌o1血清型又可以被分为o1古典型和eltor生物型，前者导致了1961年以前霍乱的前六次世界大流行，后者首先在印尼被发现随后导致了霍乱的七次爆发。o139菌株是比较新的一类致病菌，它的致病基因可能来源于可转移的致病因子。1992年南亚爆发了霍乱疫情，o139菌株第一次被分离出来。现在o1和o139霍乱菌株都可以引起霍乱的周期性爆发。一些环境菌株和非o1和o139菌株也可以引起霍乱症状，但是人们普遍认为它们缺乏引起霍乱地方性流行的能力。对霍乱弧菌的研究直接影响到人类的生存，其生物学特性、致病机理和疫苗研制等方面的研究一直是全面认识霍乱与霍乱弧菌以及控制霍乱流行的重要基础。
自然状态下，霍乱弧菌以浮游状态或者以附着于生物体和非生物体表面状态存在于海洋，河流和淡水湖泊中。因此，热带或亚热带临海国家和地区多易爆发霍乱病情。在我国饮用水是霍乱传播的主要载体，所以食用生的或者未煮熟的海产品也会引起霍乱的感染。大量研究证明，霍乱弧菌可以定殖于浮游生物的几丁质外壳和消化道内，并且附着于物体表面可以明显提高霍乱弧菌的抗酸能力。在一般情况下，由于人体胃内的ph值很低是强酸环境，只有当菌体数量达到106以上时才可成功感染人体，但是霍乱弧菌以附着于食物表面的方式进入人体时，感染量可以较少到100个细胞。
2. 研究的基本内容和问题
2.1敲除菌株的构建；
2.2研究霍乱弧菌中高亲和力的锌转运蛋白基因的敲除株在不同培养基中对锌离子的敏感性
2.3研究相关调控表达关系
3. 研究的方法与方案
3.1敲除菌株的构建；
3.1.1构建Δvc2081-2083(znu abc transporter) 以及 Δvc0378（zincuptake regulator zur）
3.1.2 regprecise 网站预测vc2553 以及 vc2554 在zur调控下表达abc-type antimicrobial peptide transport system。所以针对vc2553-2554(abc antimicrobial peptidetransport system), 构建Δvc2553-2554 和Δvc2081-2083vc2553-2554，研究Δvc2553-2554对锌离子的敏感性以确定vc2553-2554表达的转运蛋白与霍乱弧菌维持锌稳态相关。预计双敲菌株Δvc2081-2083, 2553-2554相对于单敲菌株Δvc2553-2554和Δvc2081-2083而言敏感性更高。
4. 研究创新点
本课题研究霍乱弧菌中高亲和力锌离子转运系统及其相应调控基因，目前已经发现vc2081-vc2083基因的缺失缺失对菌株在锌离子缺失的环境下的生长有明显抑制作用，同时也导致了霍乱弧菌在体内体外的竞争性定殖能力也有相应下降。本课题对于霍乱弧菌的传播与致病性研究有相应贡献。
5. 研究计划与进展
本课题计划完成：敲除菌株的构建、研究霍乱弧菌中高亲和力的锌转运蛋白基因的敲除株在不同培养基中对锌离子的敏感性、研究相关调控表达关系、研究相应基因敲除对菌株竞争性定殖能力的影响
长期以来文献中报道细菌中Zinc Uptake regulator Zur 是专门调控High-affinity zinc uptake ABC transporter,但现在发现霍乱弧菌中除了vc2081-2083表达Zinc uptake system以外vc2553-2554基因的缺失也会导致菌株在离子缺失的环境中生长受到抑制，目前正在研究vc2553-2554与Zur之间十分存在调控关系，如果vc2553-2554确实受到Zur 的调控，那么可能可以证明在霍乱弧菌中Zinc uptake system 中受到Zur调控的除了Znu ABC transporter以外还有其他transporter。
