Bacillus amyloliquefaciens SQR9协助植物耐盐的分子机制研究开题报告

1. 研究目的与意义、国内外研究现状（文献综述）

植物根际促生菌（plant growth promoting rhizobacteria，pgpr）是指定殖于植物根际土壤，能够促进植物生长，提高植物抗逆性的一类细菌。根据pgpr定殖于根际的位置，可将其分为两类：一类为胞外pgpr(extracellular pgpr, epgpr)，定殖于根系细胞外，不形成根瘤，但能通过产生信号物质促进植物生长，提高植物抗性；另一类为胞内pgpr（intracellular pgpr, ipgpr），一般只定殖于某些植物组织或细胞内，形成根瘤。在无胁迫或有胁迫环境下，pgpr通过一系列直接或间接的调控，促进植物生长、发育。

盐胁迫主要包括渗透胁迫、离子毒害以及高盐引起的营养亏缺、氧化胁迫等一系列的次生胁迫。这些胁迫使得植物生长受到抑制光合作用下降，能耗增加，最终加速衰老而死亡。在盐胁迫情况下，植物的根会释放各种物质作为植物传递给细菌的分子信号物质，有益菌帮助植物抵抗盐胁迫。

生长在盐胁迫环境中的植物形成了一系列保护自身免受或减弱盐胁迫伤害的措施主要分为五个方面：（1）渗透调节作用；（2）离子转运与平衡；（3）抗氧化保护；（4）光合作用；（5）激素调节。渗透调节指植物处在渗透胁迫条件下，细胞中有活性和无毒害作用溶质的主动净增长过程，使细胞水势降低，能够从周围环境中吸收水分，这类物质包括无机离子如k 等和有机小分子物质如可溶性总糖、脯氨酸、甜菜碱、苹果酸等。离子转运与平衡主要与na 、k 有关，植物可通过减少na 的流入、增加na 的排除、将na 在液泡中的区隔化，以及增加k 的吸收，从而提高na /k 比来减轻na 的毒害。抗氧化保护主要由过氧化氢酶、过氧化物酶、谷胱甘肽转移酶等消除植物积累的活性氧和其他毒性物质，减少对膜系统的破坏。盐胁迫环境下，植物可以通过调整光系统增加对光能的捕获和传递，提高1,5-二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶羧化能力增加对co₂的固定等方式减缓光合速率的下降。

2. 研究的基本内容和问题

研究目标

拟南芥、玉米在一系列盐浓度环境下，施加植物根际促生菌bacillus amyloliquefaciens sqr9对植物耐盐的促进能力，并进一步探究植物在接种bacillus amyloliquefaciens sqr9之后所产生的一系列与耐盐相关的分子机制。

研究内容

3. 研究的方法与方案

研究方法

（1）CAT、POD活性测定

称取一定量植物叶片，加入适量磷酸缓冲液，研磨至匀浆，离心取上清，即得粗酶液。以加热煮沸5min的酶液为对照，加入反应体系，37℃水浴，在合适波长下测定吸光度值。

（2）可溶性糖含量测定

称取植物样品研磨至匀浆，沸水浴抽提，离心取上清液定容。取少量溶液，加入蒽酮乙酸乙酯试剂和浓硫酸，沸水浴加热，，在630nm波长下测定吸光度。

（3）叶绿素含量测定

称取新鲜样品于研钵中，加少量石英砂和碳酸钙及95％乙醇，研磨至匀浆，过滤，用95%乙醇洗涤沉淀至变白，用乙醇定量。在波长665nm、649nm和470nm下测定吸光度。

（4）脯氨酸含量测定

（5）ABA含量测定

称取一定量新鲜植物样品，研磨、离心、纯化，用酶联免疫试剂盒测定样品中ABA含量。

（6）基因表达量测定

用试剂盒提取植物RNA，经过去DNA、反转录，设计一系列引物，进行荧光定量PCR，与内参进行对比。

技术路线

实验方案

（1）种子消毒，发芽，用1/4 Hoagland营养液培养，待生长至两叶一心开始盐处理并随机分为实验组和对照组，实验组接活菌，对照组接灭活的菌，处理一个月。

（2）测量植物株高、鲜重以及干重，并测定其POD、CAT等酶活性，可溶性糖、叶绿素、脯氨酸、ABA等含量。

（3）根据文献中已报道的与植物耐盐相关的基因，结合上述生理生化特征，设计引物，对得到的mRNA经反转录之后，进行荧光定量PCR，与内参基因对比，确定其上调或下调情况。

（4）根据生理生化数据，结合分子结果，初步确定Bacillus amyloliquefaciens SQR9协助植物耐盐的途径。

4. 研究创新点

植物根际促生菌可以帮助植物抵抗生物胁迫和非生物胁迫。研究表明，PGPR的作用机制主要有两类：一类是诱导体系抗性(ISR)；另一类是诱导体系忍受力(IST)。前者指PGPR能产生抗生素、毒素抵抗真菌、病原菌等生物胁迫，后者指PGPR能帮助植物耐受盐、干旱等非生物胁迫。

目前，对诱导系统抗性（ISR）的研究报道较多，而对诱导系统耐受力(TST)的研究相对较少。本课题主要研究植物根际促生菌Bacillus amyloliquefaciens SQR9对非生物胁迫的作用，尤其是在盐胁迫下对玉米、拟南芥的缓解作用。通过设置一系列盐浓度梯度，对比该促生菌的作用效果，并筛选Bacillus amyloliquefaciens SQR9协助植物耐盐的防御途径。

5. 研究计划与进展

2013.11-2013.12 文献查阅及相关实验技能训练

2013.12-2014.01 预实验

2014.01-2014.04 正式实验，测定一系列生理生化指标及相关分子实验