1. 研究目的与意义、国内外研究现状（文献综述）
1、课题目的及意义：肝脏是人体最重要的器官之一，行使许多功能，包括代谢、解毒和内环境的平衡等。
肝癌是指发生于肝脏的恶性肿瘤，包括原发性肝癌和继发性肝癌两种。
人们日常说的肝癌指的多是原发性肝癌。
2. 研究的基本内容和问题
（一）研究目标 利用crispr/cas9技术高效基因突变技术，在斑马鱼模型中构建与人类肝癌发生相关的遗传家系（nf2），对纯合突变体中肝脏发育及病变过程作定量定性分析（二）研究内容 1. 综合运用经验和软件设计高效的针对nf2基因的cas9靶位点，并得到相应的grna和cas9 mrna。
2. 运用显微注射技术，将grna和cas9 mrna混合注射进入斑马鱼单细胞期胚胎，诱导突变。
3. 逐代筛选斑马鱼突变，直至获得纯合突变，构建nf2斑马鱼突变家系。
3. 研究的方法与方案
（一）研究方法、实验方案1、设计cas9靶位点 cas9 在基因中的靶位点（靶点）包含20 个碱基，其中5端应为gg；紧邻靶点3端的3 个碱基构成pam 区，要求序列为ngg（n 为任意碱基）。
而且为保证基因敲除的效率，靶位点尽量选择在基因cds的前2/3区域并且在atg 之后，且靶位点序列应具有高度特异性。
根据这些原则，运用ensembl、zifit、ncbi等软件设计cas9位点。
4. 研究创新点
1、目前国内外尚未有以斑马鱼为模式动物构建NF2肝癌模型的报道。
2、CRISPR/Cas9技术应用于肝癌相关突变鱼系模型构建技术成熟后，可用于造血相关疾病方面的研究。
5. 研究计划与进展
本实验计划预计一年左右完成，毕业设计期间只能完成部分任务。
2014.2.28-2014.3.5进行相关实验操作培训及准备； 2014.3.5-2014.3.12设计NF2的Cas9靶位点，并合成相应的oligo； 2014.3.13-2014.3.19 构建gRNA体外转录载体，并转录得到gRNA； 2014.3.20-2014.4.5完成显微注射以及F0胚胎突变率检测； 2013.4.6-2014.5.15培养F0，完成F0生殖系突变检测，并得到F1；2013.5.15-5月底完成全部研究内容，总结，撰写毕业论文。
