1. 研究目的与意义、国内外研究现状（文献综述）
嗜线虫沙雷氏菌（serratia nematodiphila）是近年一种新发现的线虫共生菌，革兰氏染色反应呈阴性。其中s. nematodiphila r187菌株是从指导教师课题组发现的昆虫病原线虫新种heterorhabditidoides rugaoensis rg081015中分离得到的一株强毒菌株[1]。对于此类新型线虫共生菌的系统分类、鉴定方法有较多研究,比如形态学分类法[2]，比其他线虫共生菌的结合共生线虫具体产物生理特性的研究国内外报道甚少。当今国际上流行转入bt基因培育抗虫作物，但由于大面积培育、种植，害虫抗性不断增强，因此急待寻找新的抗虫基因[3]，利用线虫共生菌与线虫共生在昆虫体内特异性的寄生行为，产生一系列毒素和次生代谢产物有杀虫毒素、抑菌物质、抗癌物质、胞外酶、胞内晶体蛋白、色素、荧光素等[4]，其中能毒害昆虫的杀虫蛋白为新型生物防治找到了突破点，抗癌物质、胞外蛋白酶也为人类医学指明了方向。
参考文献:
[1] zhangk y,liu x h, tan j , wang y, qiao l, yedid g, dai cs, qiu rl, yan x w, tan hw, suzy, lai r, gao g f. heterorhabditidoides rugaoensis n. sp. (rhabditida: rhabditidae), a novelhighly pathogenic entomopathogenic nematode member of rhabditidae. journal of nematology. 44(4):348-360, 201. [2] poinar gojr. description and biology of a new insect parasitic rhabditoid, heterorhabditisbacteriophora n.gen n. sp[j]. nematologica,1976,21:463-470.
[3]阚飞.昆虫病原菌菌株rg-1的分离鉴定及其杀虫毒素蛋白的分离纯化与活性研究[d].南京.南京农业大学，2009:1.
2. 研究的基本内容和问题
在了解昆虫病原线虫及其共生菌分类的基础上，分析共生菌致病昆虫的基本原理，分离得到嗜线虫沙雷氏菌(serratia nematodlphila) r187杀虫毒素蛋白是此次研究实验的最终目的。并期望能为生物防治领域寻找新种昆虫病原线虫、有效的防治耐药性昆虫尽绵薄之力。
分离嗜线虫沙雷氏菌r187杀菌毒素蛋白的第一步是研究菌体对寄主大蜡螟的致病性，从制备菌体发酵上清液开始，确定嗜线虫沙雷氏菌r187杀虫毒素蛋白属于胞外蛋白。实验研究的整个过程以分离杀虫毒素蛋白为主要内容，为保证杀虫蛋白的纯度及实验准确性，分离纯化阶段将有杀虫毒力检测得到活性峰，得到实事求是的数据资料，通过对比证明杀毒蛋白纯度在逐步提高。
分离得到目的杀虫毒素蛋白后运用一定的分子质量检测方法（电泳）大致确定杀虫毒素蛋白的相对分子质量即是研究拟解决的关键问题。
3. 研究的方法与方案
① 技术方法：从如皋线虫rg081015分离得到嗜线虫沙雷氏菌r187菌种可以采用的方法有：通过饲喂被如皋线虫rg0810侵染了的大蜡螟，36小时后将大蜡螟血淋涂布于鉴定培养基，去除杂菌污染，通过鉴别得；亦可通过碾碎侵染期表面消毒的线虫涂布、鉴定得到；通过实验甘油保存的嗜线虫沙雷氏菌r187菌种活化是最直接有效的方法。通过破碎菌体、冷冻离心、滤膜过滤等手段制备杀虫蛋白粗提物，之后的初步分离纯化所采用的方式主要有过sephadex g-75分子筛色谱、过deae-sepharcy ff阴离子色谱的方法，每一步得到杀虫蛋白都保证冻干备份低温储于冰箱，利于后续试验或重复试验。
② 研究方法：在通过分子筛分离纯化后采用喂食大蜡螟初孵幼虫和注射大蜡螟老熟幼虫的方式分别验证杀毒蛋白的胃毒活性或血腔毒力，以此对比得到最佳活性峰，采集数据用到的分析公式如下：
死亡率(%)=(死虫数/供试虫数)100
4. 研究创新点
① 保证寄主大蜡螟的实验营养配比接近天然生活条件，有效的保证线虫寄生时嗜线虫沙雷氏菌R187能正常分泌杀虫蛋白，且在利用大蜡螟验证毒性时精确实验；在培养基配置过程中严格杀菌，减少因杂菌污染过多的重复实验。
②研究采用从拟异小杆线虫属新种如皋线虫RG081015分离得到的嗜线虫沙雷氏菌R187研究，即得到了分离蛋白的部分物理特性，将丰富有机农药的抗虫谱，也将扩大人们对其共生昆虫病原线虫的理解认知范畴。
5. 研究计划与进展
嗜线虫沙雷氏菌r187菌种通过甘油保存或低温临时保存，活化、发酵确保正常分泌杀虫蛋白，这是后续实验进行的基本前提。
将甘油保存的嗜线虫沙雷氏菌r187菌株接种培养基培养后通过硫酸铵沉淀的方法制备蛋白粗提取物冻干，运用对照实验的方法测定其对大蜡螟的毒力，计算得到校正死亡率。将蛋白粗提取物冻干用于后续两步杀虫蛋白的初步分离纯化（过sephadex g-75分子筛色谱、过deae-sepharcy ff阴离子色谱），注重柱子的平衡、洗脱，经过紫外分光光度计度记检测后分别收集蛋白峰冻干，分别计算胃毒活性或血腔毒力的校正死亡率。
对最后得到唯一的活性峰杀虫蛋白进行sds-聚丙瑞酰胺凝胶电泳。将得到经过分子筛和离子柱分离纯化后嗜线虫沙雷氏菌r187菌株杀虫蛋白的分子电泳图，结合蛋白marker的迁移速率，绘制相对迁移率与蛋白maker相对分对数值的标准曲线，求得线性回归方程，初步得到杀虫蛋白的相对分子质量。
