1. 研究目的与意义、国内外研究现状（文献综述）
病原细菌一般通过分泌系统介导对宿主的致病作用，革兰氏阴性病原细菌能够分泌蛋白毒素进入外界环境，或者直接作用真核细胞的靶位点使宿主致病[1]。
目前已发现革兰氏阴性细菌至少存在6种分泌系统，即Ⅰ型到Ⅵ型（t1ss到t6ss），t6ss是最新发现的一种分泌系统，广泛存在于革兰氏阴性菌变形菌门的细菌中[2]，主要由构成分泌系统的结构蛋白、形成跨膜管道结构的转位蛋白、分泌蛋白以及一些对分泌系统起辅助功能的蛋白组成[3][4]。
t6ss的结构装置横跨细菌细胞内膜-周质-外膜，能够一步将效应蛋白转运出去并直接到达宿主细胞内，其转位蛋白缺少n-端信号肽序列，转运过程中不需要识别分泌蛋白的n-端信号肽[5][6]。
2. 研究的基本内容和问题
目标：对沙雷氏菌中的t6ss相关蛋白进行克隆表达纯化。
内容：采用基因工程方法将沙雷氏菌的t6ss相关蛋白转入大肠杆菌进行克隆表达，并进行分离纯化。
关键问题：选择合适的载体、诱导表达条件及纯化方法，以获得表达量大、纯度高、有活性的蛋白。
3. 研究的方法与方案
研究方法：应用分子克隆、蛋白质分离纯化、琼脂糖凝胶电泳、sds-page等技术，对沙雷氏菌中的t6ss相关蛋白进行克隆表达及纯化。
技术路线：见附件。
实验方案：1 目的基因的pcr扩增及扩增产物回收纯化以serratia sp.fs14菌体为模板，引物两端引入酶切位点，通过pcr扩增获得t6ss相关蛋白的dna片段，用琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物，回收纯化阳性条带。
4. 研究创新点
沙雷氏菌的Ⅵ型分泌系统相关蛋白目前仅有少数被纯化研究，本项目将对未被解析晶体结构的相关蛋白进行克隆表达。
5. 研究计划与进展
2014.9 文献查阅及引物设计2014.10-2014.12 目的蛋白的克隆表达2015.1 -2015.3目的蛋白的分离纯化2015.4 实验总结与论文撰写以上为大体工作的时间安排，具体工作将会根据情况进行调整或穿插进行。
