1. 研究目的与意义、国内外研究现状（文献综述）
自养微生物包括光能自养微生物和化能自养微生物两种类型，它们具有环境适应性强、种类多、数量大、分布广的特点，能够直接固定二氧化碳。
miltner a等应用同位素示踪技术室内模拟培养试验研究结果表明，农田土壤微生物对 co2 的固定量最高可达呼吸排放量的3%~5%。
yuan等研究表明，农田土壤自养微生物能将 co2转化成有机物质，其同化速率约为 0.0134~0.103 g cm-2 d-1。
2. 研究的基本内容和问题
我们采用微宇宙培养方法，选择南方免耕稻田典型研究区域两种免耕水稻土，并设置13CO2标记与12CO2对照处理，结合PCR-RFLP技术直接示踪分析二氧化碳固定微生物多样性，为深入理解稻田土壤固碳过程提供一条新的思路，为调控土壤固碳能力提供科学依据。
为了实现上述目标，本课题将从以下四个方面开展系统的科学研究：1. 利用DNA-SIP技术处理稻田土壤并超速离心获取总DNA分层样品；2. 实时荧光定量分析不同浮力密度DNA中13C-DNA富集程度； 3. 采用PCR-RFLP技术对不同土壤分层样品固定CO2功能基因（cbbL、cbbM、coxL、aclB）构建基因文库；4. 分析免耕稻田土壤中二氧化碳固定自养微生物多样性与影响因素。
3. 研究的方法与方案
实验按照以下步骤进行：1、功能基因cbbLR的PCR扩增2、感受态细胞的制备3、 PCR产物的TA克隆4、普通感受态细胞酶连产物的转化5、克隆文库的构建与保存6 、PCR扩增验证转化子7、 cbbLR基因文库的RFLP分析8、 cbbLR基因文库统计分析
4. 研究创新点
1、 对CO2固定自养微生物分子多样性进行系统研究，明确免耕稻田土壤CO2固定速率为0.10～0.49μg13Cg-1d-1，可促进对土壤固碳功能的新认识。
2、 将13C-DNA-SIP技术与PCR-RFLP方法结合研究固碳微生物，发现化能营养型Bradyrhizobium、Azoarcus和Methylibium是该免耕稻田土壤环境的主要固碳微生物类群。
5. 研究计划与进展
预期结果与可能存在的问题1.定量分析cbbl、cbbm、coxl和aclb四种功能基因在不同浮力密度dna中的拷贝数变化规律，13co2处理土壤在浮力密度较重的 dna中应检测出大量的功能基因，而12co2对照处理功能基因富集于轻浮力密度dna中，表明固碳细菌基因组 dna 被成功标记并得到有效分离。
2.构建各功能基因文库及系统发育分析，其中13c标记与12c对照处理土壤样品相比，相对应的浮力密度层固碳细菌种属分布和相对丰度存在差异，13c标记处理样品出现较12c处理样品明显占优势的固碳菌，不同土壤类型固碳细菌种属分布和相对丰度也不同。
3.一般情况下，环境样品中的目标微生物很难被同位素 100% 标记，而dna 被稳定性重同位素标记的程度要求较高，不容易控制，可能出现标记不完全的情况。
