1. 研究目的与意义、国内外研究现状（文献综述）
1研究意义： 在原核生物中，大肠杆菌是第一个用于重组蛋白生产的宿主菌, 它不仅具有遗传背景清楚、培养操作简单、转化和转导效率高、生长繁殖快、成本低廉, 可以快速大规模地生产目的蛋白等优点, 而且其表达外源基因产物的水平远高于其它基因表达系统, 表达的目的蛋白量甚至能超过细菌总蛋白量的30 , 因此大肠杆菌是目前应用最广泛的蛋白质表达系统。
而与之相对应的在真核生物中，毕赤酵母pichia pastis表达系统是近几年发展起来应用最为广泛、优异的真核外源基因表达系统之一。
因为该系统可以对外源蛋白进行翻译后的高水平加工修饰，其高蛋白表达量，高酶活表达水平，高密度发酵水平，低廉的培养成本，遗传性状稳定等特点受到了工业生产上的广泛关注。
2. 研究的基本内容和问题
1研究目标：比较大肠杆菌表达系统和毕赤酵母表达系统对于丝状真菌来源木聚糖酶表达能力的差异，分析不同启动子对于该基因的表达强度 2研究内容： (1)木聚糖酶基因的获得与表达载体的构建 (2)大肠杆菌和毕赤酵母工程菌的构建 (3)木聚糖酶的纯化与鉴定 (4)重组菌最适产酶条件探究 (5)木聚糖酶酶学性质研究 (6)木聚糖酶酶动力学研究 3研究的关键问题：定量比较不同表达系统之间产酶能力与酶学性质差异的方法构建
3. 研究的方法与方案
1研究方法： (1)比对获得的木聚糖酶基因序列 (2)扩增目的基因片段 (3)采用一步克隆试剂盒将目的基因与载体相连接，构建表达载体 (4)采用电击转化构建重组转化子 (5)采用硫酸铵沉淀和层析分离纯化重组酶，western blot与质谱鉴定蛋白 (6)采用bca定量蛋白，dns法测定酶活 2技术路线：比对获得g/11家族木聚糖酶基因序列、扩增目的基因构建两种不同启动子表达载体、电击转化大肠杆菌和毕赤酵母表达菌株 获得响应转化子、重组酶高效表达与纯化鉴定，同时进行连续传代实验验证基因丢失率、寻找不同转化子最适发酵条件、测定各重组菌生产的木聚糖酶酶学性质、测定各重组菌生产的木聚糖酶动力学参数、分析各表达系统对丝状真菌来源木聚糖酶表达能力 3实验方案： (1)实验前的准备：由于本实验进行操作的菌株中含有丝状真菌，它在生长的过程中能够产生大量孢子，及其容易造成实验污染问题，因此在进行本项目实验之前，应掌握严格的真菌无菌操作技术。
在开展实验之前，需要准备充足的真菌和细菌生长所必须的液体或固体培养基（pda、lb等）；各种实验过程中的所需的无菌容器（三角瓶、ep管、50ml离心管等）；实验进行所必须的化学试剂订购以及各种商业试剂盒的购买（真菌rna提取试剂盒、反转录试剂盒、pcr试剂盒、酶切酶连试剂盒、ta克隆试剂盒等）； (2)木聚糖酶基因片段的获得：实验室的前期研究过程表明，烟曲霉z5 具有优秀的木聚糖降解能力，因此本实验选取了烟曲霉z5基因组上三个能够表达三种不同纤维素降解酶的基因作为研究对象。
首先，用固体pda培养基活化烟曲霉z5，进行一次转接培养后取z5的新鲜孢子，定量后接种于蔗糖作为唯一碳源的液体完全培养基中进行菌丝体生长；24小时后，将生长好的z5菌丝体用无菌水洗净并转接入木聚糖作为唯一碳源的液体诱导培养基中进行目的基因的诱导培养；5小时后，取适量菌丝体进行液氮研磨并提取总rna进行反转录实验获得目的基因的cdna片段；采用预先设计好的引物，通过puf酶体系进行pcr扩增获得大量的目的基因双链dna片段。
4. 研究创新点
(1)烟曲霉z5（aspergillus fumigatus z5）具有很强的降解木质纤维素的能力，其基因编码的木聚糖酶是非常有潜力的工业用酶。
本实验扩增了三个潜在的f/10家族的木聚糖酶的基因，构建并获得高产的重组型毕赤酵母和大肠杆菌工程菌株； (2)毕赤酵母表达系统是一类重要的真核表达系统，其耗用营养物质的水平较低，培养价格低廉，最适用于高密度高产量的发酵。
本实验比较了两种不同的启动子对于丝状真菌来源木聚糖酶基因的表达强度，同时对比x33、gs115、km71三种不同表达宿主对于木聚糖酶的表达能力，对于后续工业生产菌株的选择具有指导意义；大肠杆菌表达表达系统，不同于一般的表达系统，它能够更好的完成真核目的基因的转录、翻译、折叠和修饰工作，从而能够得到更加接近原始菌株活性木聚糖酶产物。
5. 研究计划与进展
1.2015.06-2016.07通过转录组数据获得三个目的基因序列，设计引物扩增得到目的段，构建不同启动子的表达质粒 2.2015.07-2015.09 构建重组毕赤酵母工程菌和大肠杆菌工程菌，获得传代稳定与高产的菌株 3.2015.09-2015.10 纯化与鉴定重组菌分泌得到的木聚糖酶 4.2015.10-2015.11 最适产酶条件探究 5. 2015.11-2015.12 重组木聚糖酶最适 pH、温度、金属离子对酶活性影响，以及 pH、热稳定性研究 6.2016.01-2016.02 木聚糖酶酶动力学研究 7.2016.02-2016.03 探究木聚糖酶的毕赤酵母连续发酵工艺与工业化应用 8.2016.04-2016.05 数据整理与论文撰写
