1. 研究目的与意义、国内外研究现状（文献综述）
大丽轮枝菌是引起我国棉花黄萎病的主要病菌【1】，属于半知菌亚门（deuteromycotina),轮枝菌属（verticillium)。大丽轮枝菌的宿主范围十分广泛，没有明显的寄主专一性，但是在不同的生理小种之间有一定程度的寄主特异性【2】。大丽轮枝菌是兼性营养型病菌，既可在活体植物中以植物的养分为生，又可以在植物感病死后以土壤中的腐殖质为生，导致棉田土壤中的菌体不断积累，黄萎病发病情况越来越严重。1993年，黄萎病发病面积达二百万公顷，其中落成光杆的严重病田就达到六十万公顷【3】。但是直到现在，仍然没有有效的药物或措施来控制棉花黄萎病的发生和发展。
sec5是exocyst复合体的一个亚基。exocyst复合体最早在温度敏感性酿酒酵母突变体中被分离发现，由sec3、sec5、sec6、sec8、sec10、sec15、exo70和exo84八个亚基组成，在酵母中介导外泌囊泡与质膜的识别过程【4】。exocyst复合体也存在于拟南芥中【5】。有研究表明，拟南芥中编码exocyst复合体亚基sec6、sec8、sec5和sec15的基因突变后导致花粉管极性生长缺陷，不能完成受精作用，导致雄性不育【6】，sec6突变导致部分花粉细胞板畸形，说明sec6至少参与了花粉第一次有丝分裂过程中细胞板的形成过程【7】。在真核生物细胞中保守的exocyt复合体是介导胞吐作用(exocytosis)的关键元件，而sec15蛋白(sec15p)是exocyst与其他蛋白及膜结构结合的中介，真核表达sec14l3及其系列突变体蛋白显示sec14l3能够促进肝癌细胞株7721的胆固醇合成【8】。小鼠模型中，sec24b基因突变会影响vangl2蛋白由内质网向高尔基体的运输过程,引起小鼠出现神经管畸形【9】。secb在大肠杆菌中参与蛋白质分泌系统，可以阻止抗蛋白酶pre-mbp的出现，稳定的结合前体蛋白，使其处于适合运输的构型【10】。在真核细胞内,sec13有两个功能：一是与sec31相互作用形成copii复合体的外围复合物参与内质网到高尔基体的蛋白转运；二是与nup145c(酵母)或nup96(脊椎动物)以及与其他核孔蛋白相互作用参与核孔复合物的形成从而调节核质转运和基因表达调控【11】。拥有特殊结构的稻曲病菌分泌蛋白在非寄主植物和寄主植物中起到引起细胞死亡或防御的功能【12】。
分泌的大丽轮枝菌素是导致黄萎病的关键因子，而sec5是与大丽轮枝菌分泌相关的基因，故研究sec5基因的功能则显得更为重要，可以为研究针对大丽轮枝菌的防治方法开辟新额理论平台。
【1】张绪振，等.我国棉花黄萎病病菌种的鉴定[j].植物病理学报，1981，11（3）：13-18.
2. 研究的基本内容和问题
研究目标：研究大丽轮枝菌分泌相关基因sec5的功能
研究内容：敲除大丽轮枝菌中的sec5基因，再用基因突变的大丽轮枝菌侵染棉花，探究基因敲除后大丽轮枝菌的致病力
拟解决的关键问题：1.基因序列的获得和分析
3. 研究的方法与方案
技术路线：
1基因敲除载体的构建。
2.将构建好的载体转入农杆菌agl-1.
4. 研究创新点
本实验为从大丽轮枝菌中敲除sec5基因，前面还没有人做过。
5. 研究计划与进展
按上述实验方案依次实验，预期在前期构好sec5基因敲除载体，中期完成农杆菌介导的黄萎病菌遗传转化过程和基因突变体的表型观察和致病力分析，后期构建基因回补载体。
