1. 研究目的与意义、国内外研究现状（文献综述）
溴苯腈（3,5-二溴-4-羟基苯甲腈）是一种广泛使用的选择性芽后茎叶处理触杀型除草剂，其具有传到活性，主要可抑制光合作用的各个过程，使植物组织迅速坏死，多用于防除阔叶杂草。溴苯腈对水生生物有较高毒性，对人类有潜在致畸作用。因此，系统研究溴苯腈及其有毒中间代谢物的降解对于农业安全及生态环境保护有着重要的意义。目前国内外对溴苯腈的研究主要涉及腈基的水解，分子层面及降解机制方面的研究较少。本实验室的陈凯博士曾报道过溴苯腈的还原脱卤及其完整的代谢途径，但单一的代谢途径及机制难以满足全球不同环境、不同农业区溴苯腈污染的治理。因此，我们亟需从不同角度、不同机制方面探索溴苯腈的降解方式。
1. 卢中秋, 刘晓, 胡国新, 等. 溴苯腈对小鼠的毒性及二巯丙磺钠对其的保护作用 [j]. 中华急诊医学杂志, 2006, 15(2): 124-127.
2. 研究的基本内容和问题
本课题旨在探索溴苯腈有毒中间代谢物及其类似物的非还原脱卤降解方式。
dbhb（3,5-二溴-4-羟基苯甲酸）是溴苯腈降解途径中的重要中间代谢物。其同样具有较高毒性与稳定性，但并非是环境异生物。本实验室从长期污染土壤中分离到一株dbhb降解菌株pigmentiphaga sp. h8 ，它能够矿化dbhb及其类似物或下游产物dchb , chb , bhb。前期实验表明其并非通过还原脱卤的方式进行降解，且类似物与dbhb不共用一条代谢途径。
目前我们的研究着力于克隆降解途径中的关建酶，分析其中间代谢物的结构，从而探索新的溴苯腈代谢途径。
3. 研究的方法与方案
1. 将菌种接种到液体lb培养基中大量培养菌体 → 加药诱导酶的表达 → 收集菌体 → 菌体破碎，释放蛋白，获得蛋白酶液 → 蛋白分离纯化 → 切胶测序 → 验证功能 → 获得基因
2. 大量培养菌体 →加药诱导酶的表达 → 收集酶液 → 进行酶反应 → 收集中间代谢物 → 核磁共振与lc-ms联合分析 → 获得代谢物结构
本实验室已获得该菌株的全基因组序列，通过蛋白纯化及比较分析，我们可以去除杂蛋白，获得目的蛋白条带，并通过测序与比对获得该编码基因的orf，通过pcr，基因敲除与回补等方式验证基因功能，从而获得基因。
4. 研究创新点
3,5-二溴-4-羟基苯甲酸（dbhb）是除草剂溴苯腈主要的中间代谢产物。由于溴苯腈的广泛使用，环境中检测到其代谢产物dbhb有很多报道。由于卤素的存在，dbhb在环境中具有一定的污染风险。
dbhb也是一种可以在海洋生态系统中自发生成的物质，如绿藻类生物石莼可以自发产生dbhb。因此，研究dbhb的微生物脱卤，对于研究海洋环境中的卤素循环也有一定的意义。
h8能够同时降解dbhb与chb，且两者具有不同的代谢途径。研究类似物chb的降解对溴苯腈降解的研究有借鉴意义，且研究同一个细菌中一个化合物家族的多种代谢途径对于研究降解菌进化、工程菌构建均有重要启示意义。
5. 研究计划与进展
1. 关键酶的克隆与研究
2. 降解产物结构分析
预期本学期内克隆出chb代谢途径中的首步降解基因（已确定为加氧酶），同时确定其代谢产物（已通过质谱初步确定）；摸索出dbhb降解酶纯化条件，通过液质初步确定其降解产物。
