番茄根系分泌物对土壤微生物群落的影响开题报告

1. 研究目的与意义、国内外研究现状（文献综述）

在植物的生长发育过程中，植物不仅从外界环境中吸收各种养分、水分，也会以根系沉积物的形式向环境中释放自身的物质，根系沉积物(rhizodeposition)，即植物残体、根系脱落的组织、细胞以及根系分泌物。

早在18到19世纪，plenk、decolle等人就观察到植物通过根系沉积物实现对邻近植物的促进或抑制，但受限于当时的条件与技术，对于根系沉积物的研究进展缓慢，其重要性一直未被发掘，直20世纪，rovira[1] 等人开始了对根系分泌物的系统研究，近年来越来越多的研究表明，植物不仅受到外界环境中理化条件、生物条件的影响，其自身也会通过来影响环境，实现植物-植物、植物-土壤-微生物的交流与对土壤环境（包括微生物环境）的改良。

根系分泌物（root exudates），即植物在生长发育过程中从根系分泌出的有机酸、糖类、氨基酸和植物激素等物质[2]。

2. 研究的基本内容和问题

研究目标

本课题旨在研究根系分泌物对番茄连作土壤微生物群落及外源入侵的青枯病病原菌的影响。

3. 研究的方法与方案

研究方法：

1. 溶液收集法收集根系分泌物

通过MS培养基培育无菌的番茄苗，出芽1周左右后移至密闭（带滤菌气孔）的容器中，在营养液中培养3d，之后移至无菌的去离子水中培养3d，如此交替培养，直至植物自然死亡。水溶液即为所收集的根系分泌物，根系分泌物分装至小组培瓶中，-80℃保存。

2. 根系分泌物的浓缩

使用冷冻干燥仪将-80℃冷冻的根系分泌物冷冻干燥成粉末，每次收集的分泌物用15ml的无菌去离子水溶解至离心管，-80℃保存。

3. 土样的采集与处理

采集长期种植番茄的土壤（种苗前采集），湿土研磨，过20目0.9mm筛子，加适量水预培养3天后，分别称取干重为8g的土壤于直径70mm的无菌培养皿中。

4. 根系分泌物与病原菌的添加

在无菌操作台中，向培养皿中添加不同浓度的根系分泌物，另处理一组添加同样梯度的根系分泌物的土壤，均加入预培养番茄青枯病病原菌Ralstonia Solanacearum至浓度为10⁷CFU/g土壤，用无菌水将所有的处理体系补足到相同的体积。

5. 使用Mobio公司的土壤DNA和RNA试剂盒提取土壤DNA与RNA。

6. 荧光定量PCR采用SYBRGREEN或TaqMan法，通过构建质粒，进行绝对定量。

技术路线

实验

将采集来的土壤过20目筛子后，按每皿8g干重的量，分装入30个培养皿中构成微生态系（microcosm），并按以下方法处理：

向培养皿中添加不同浓度的根系分泌物，浓度为每棵收集得到的苗的根系分泌物处理10、20、50、75g土壤的量和不添加根系分泌物，另处理一组添加同样梯度的根系分泌物的土壤，均加入预培养的番茄青枯病病原菌Ralstonia Solanacearum至浓度为10⁷CFU/g土壤。用无菌水将所有的处理体系补足到相同的体积。每个处理设3个重复。

28℃培育18天，期间每3天添加一次根系分泌物或水，每6天取样一次。期间控制土壤的含水量。

可行性分析：

根系分泌物在无菌的容器中收集，溶液收集法所得的分泌物较为完整，且无菌程度高，较为可靠。

而在数据获取方面，通过成熟的稀释涂布法，对土壤中可培养的真菌、细菌、放线菌和病原菌R.S.进行计数，简单可靠。此外，可通过 Real-Time qPCR，采用绝对定量的方法，获得可靠的拷贝数数据。土壤微生物群落变化后其DNA可能不能及时降解，故可在最后一次取样时通过提取土壤总RNA后进行反转录PCR，再进行定量的方式，与DNA的定量结果互为印证。课题完成人已经掌握了相应实验技能，预计能够顺利完成研究。

4. 研究创新点

特色或创新之处 1. 根系分泌物的收取本实验根系分泌物的收取方法是将无菌苗通过水培的方法培育在密闭的容器中（上有透气但滤菌的滤膜），比传统的溶液收集法收到的根系分泌物无菌程度更高，收集到的分泌物不会被收集时带入的微生物降解，保证成分更为接近原位状态。

2. 根系分泌物的浓缩根系分泌物在-80摄氏度保存并通过冷冻干燥的方法浓缩，整个过程都保持在-80摄氏度的状态，物质较为稳定。

并且，通过浓缩，溶剂（水）对于微生态体系影响更小，使得土壤的含水量等保持在较为稳定的水平，进而对结果干扰更小。

5. 研究计划与进展

研究计划及预期进展 2015年9月-11月 完成根系分泌物的收集 2015年11月-2016年1月 完成土培实验 2016年2月 进行RNA提取与反转录 2016年3月-4月 完成定量、测序与分析工作 2016年5月 撰写并完成结题报告