定点突变改造枯草芽孢杆菌脂肪酶热稳定性的研究开题报告

1. 研究目的与意义（文献综述包含参考文献）

1.1.1脂肪酶概述

脂肪酶（1ipase,ec3.1.1.3）即三酰基甘油酰基水解酶，是一种特殊的酯键水解酶，它可以在油水界面上催化油脂的水解反应，生成脂肪酸和甘油、甘油单酯或二酯[1]。脂肪酶通常被用于在非水相体系中催化油脂及其它一些水不溶性酯类的水解、醇解、酯化、转酯化以及酯类逆向合成等反应[2-4]。由于其高效专一、反应条件温和等特点，已有越来越多的脂肪酶在油脂加工、造纸、食品、医药和日化等行业中得到应用[5]。

在自然界中，脂肪酶广泛地存在于植物，动物及微生物等生物体中。与来自于植物和动物的脂肪酶相比，微生物的脂肪酶（主要来自于细菌和真菌），种类繁多，催化活性高，易于基因操作，稳定性高，生产方便且安全，产量高等优点[6]，因而在生物工业和有机化学领域应用非常广泛[7]。其中，以来源于pseudomonas的脂肪酶为典型代表[8-10]。一些重要的工业用酶也已经从植物体中分离出来，如羟裂合酶（hnls）。另外，一些常用的工业用酶也有从动物体内的脂肪组织和胰脏获取，如从猪胰中分离的ppl。

1.1.2 枯草芽孢杆菌脂肪酶a简介枯草芽孢杆菌脂肪酶a（简称bsla）是由枯草芽孢杆菌（bacillus subtilis）分泌产生的一种胞外水解酶。编码bsla的lipa基因位于b. subtilis基因组291,800 bp处，结构基因全长为 636 bp，编码212个氨基酸，这些氨基酸组装成的脂肪酶前体。bsla前体在后加工过程中去掉31个氨基酸的信号肽，得到的181个氨基酸组装折叠成bsla，其分子量仅为19kda。研究发现，与其它微生物脂肪酶不同，bsla没有保守的五肽结构：gly-x-ser-x-gly，取而代之的是ala-x-ser-x-gly， ala取代了保守五肽序列第1位的gly，并且这种取代并没有引起亲核区域的主链构象发生较大的改变。

剩余内容已隐藏，您需要先支付后才能查看该篇文章全部内容！

2. 研究的基本内容、问题解决措施及方案

1.计算机辅助的迭代饱和突变技术为研究脂肪酶催化机制提供新的方法

随着蛋白质工程技术的发展，为高效快速开发适合目标反应的新酶提供了便利。目前，蛋白质工程技术主要有以定点突变为代表的理性设计和以随机突变为代表的定向进化两种方法。这两种方法在提高酶蛋白的选择性、活性、稳定性等方面获得了较大的进展，成为国际研究热点，但也有各自的优劣：理性设计目的性强、成功率较高，但是突变位点少，往往只能进行单点突变，且它的应用受到蛋白质结构及功能关系复杂性的限制；定向进化不需要完全了解蛋白质结构及其功能的关系，但需要建立有效的高通量筛选方法，筛选容量大、过程复杂，往往会耗费大量的人力、物力。2006年，Reetz研究团队在国际上率先提出一种称作迭代饱和突变(Iterativesaturationmutagenesis,ISM)的半理性蛋白质设计策略。ISM是以笛卡尔坐标系中蛋白质三维结构为基础，在定向进化的基础上加入了理性设计的元素，将随机突变限制在提高酶某一催化功能的几个预选位点上，进行多轮饱和突变的迭代循环，实现快速定向进化。拟定野生型酶的若干个与对映选择性有关的突变位点(突变位点有1-3个氨基酸组成)，对各个位点进行首轮的定点饱和突变，构建突变体文库，筛选正向突变，从中选出的理想突变体作为下一轮其它位点饱和突变的模板，依次循环迭代直到筛选到最佳的正突变体。与易错PCR、DNA重组以及饱和突变等目前较为流行的定向进化手段相比，ISM能在较小的突变库中获得性能明显改善的突变体，大大提高正突变的机率；同时，能从突变体文库分析中剔除选择错误的突变位点。ISM这种新的蛋白质工程技术在酶分子改造中的应用属国际先进研究技术，有极高的科学实用价值，可以有效对酶分子进行改造。因此可以设想，将迭代饱和突变技术在计算机虚拟运行环境中进行蛋白活性位点设计与筛选、诱变优劣评价等操作，确定最佳设计方案，可以大大降低分子生物学实验工作量，并有效提高酶分子改造的可预测性，最终使酶的选择性、活性和稳定性全部或部分达到理想状态。