1. 研究目的与意义、国内外研究现状（文献综述）
（一）、课题的研究意义目前国内对细菌素的研究还尚不完善，而能广泛利用的细菌素品种尚且不多。
传统的抗生素和食品防腐剂等已经越来越不符合人们对食品新鲜和安全的需求，因而需要寻找安全的天然有效的活性抑菌物质即细菌素成了当代研究的内在要求。
考虑到目前能应用于食品生产中的细菌素种类非常有限，本课题拟选择对单增李斯特菌具有抑制作用的屎肠球菌b1为研究对象，提取纯化其细菌素，进而对其细菌素的结构性质做出进一步研究，为其能早日应用于食品生产中提供重要依据。
2. 研究的基本内容和问题
（一）、研究的目标、内容和拟解决的关键问题1、研究目标本课题拟选择对单增李斯特菌具有抑制作用的屎肠球菌b1为研究对象，提取纯化其细菌素，进而对其细菌素的结构性质做出进一步研究，为其能早日应用于食品生产中提供重要依据。
2、研究内容以屎肠球菌b1为研究对象，通过对其进行培养提取dna确定其所分泌细菌素的类型，进而采用硫酸铵提取，进一步纯化后对其进行分子量，空间结构的测定，以便对其代谢产物的作用机理与实际应用提供理论依据。
3、拟解决的关键问题现如今对屎肠球菌b1细菌素的研究尚未达分子层面，通过此课题对其空间结构做出预计，结构决定性质，如果对其结构有了具体的认识，就可在日后的进一步研究以及其应用于工业生产中大有帮助。
3. 研究的方法与方案
（二）、研究方法、技术路线、试验方案及可行性分析1、研究方法及试验方案（1）菌种的选择 目标筛选菌株的活化屎肠球菌b1分别采用m17、tsa、lb、mrs液体培养基进行活化，单增李斯特菌用bhi培养基37度活化两次恢复活力，备用 琼脂扩散法筛选乳酸菌细胞上清液的抑菌作用a提前取20ml1.5%的已灭菌的琼脂倾倒在平板上b取倒好的平板加入400ul单增李斯特菌培养液涂布均匀c将6mm牛津杯放置于平板上，内部加入200ul屎肠球菌培养液d将平板于4度下扩散4小时e 37℃培养24h。
游标卡尺测定抑菌圈直径的大小（2）pcr鉴定 dna提取a取细菌培养液1ml，在10000r下离心90s，尽量吸尽上清液b加入溶菌酶（20mg/ml购置的溶菌酶浓度为100mg/ml，需要稀释过后使用）20ul，金属浴37度处理1h，破壁c向管中加入20ul蛋白酶k，混匀，金属浴55度处理2hd加入220ul缓冲液gb，震荡15s，70度放置10min，溶液应变清亮，简短离心除去管壁水珠e加220ul无水乙醇，充分震荡15s，简短离心除去管壁上水珠f将所得溶液和絮状物都加入吸附柱中，吸附柱放入收集管中，12000r离心1min，倒掉废液，吸附柱放回收集管中g缓冲液gd与pw按照标签要求加入无水乙醇h向吸附柱中加入500ul缓冲液gd，12000r离心1min，倒掉废液，吸附柱放回收集管中i向吸附柱中加入700ul缓冲液pw，12000r离心1min，倒掉废液，吸附柱放回收集管中j重复上步骤，但是是缓冲液量为500ulk将吸附柱放回收集管中，12000r离心2min，倒掉废液，吸附柱置于室温开口放置20min，以彻底晾干吸附材料中残余漂洗液l将吸附柱转移至干净的离心管中，向吸附膜中间部位悬空滴加100ul洗脱缓冲液te，室温放置5min，12000r离心2min，将溶液收集到离心管中m将所得溶液用nanop2000测其浓度与纯度（a280nm/a260nm），打开仪器电脑，点击nanop2000快捷方式，选择核酸测定（nucleic acid），进入测定阶段。
使用前要先使用te调空白（blank）,f1为测试样品的快捷键 pcr扩增a分装预混液，每个pcr小管25ul，将整管绿色物质一次性全部分装b将所需的引物12000r离心两分钟c按照引物上要求加入free dna h2o，保证每瓶引物浓度为10um/ul，震荡混匀d取分装好的pcr小管（至少一个空白对照），标号，加入上下游引物各2ul,无菌水1ul，模板50ng-100ng，再用无菌水补至体积为50ul，震荡混匀按照反应所需体系进行pcr扩增e扩增反应条件：预变性在94度下进行3min，变性在94度下进行30s，退火在55度下30s，延伸72度下30秒，变性、退火、延伸循环30次，终退火72度下进行600秒f扩增反应体系：10xtaq buffer、5ul，taq dna聚合酶0.25ul，dntps、5ul，模板dna（25 ng/μl）2.00ul，上游引物（10 pmol/μl）2.00ul，下游引物（10 pmol/μl）2.00 ul，ddh2o、25.75ul，总体积50.00ul（3）琼脂糖电泳（2.5%的琼脂糖凝胶配制方法）a称取1.7g琼脂糖b 50x tae缓冲液稀释至1x，50ml与琼脂糖加入锥形瓶，顺时针摇匀c用微波炉加热（先30s，摇匀，再加热至胶完全融化至清亮）至澄清，摇匀d加入gelrad 10000x 5ul，摇匀e倒在器皿上，将梳子插在上面，自然冷却凝固f按住胶体，将梳子垂直，尽量使加样孔不扩张g将胶体连同塑料板一起放入电泳设备中（dna带负电荷，从黑色负极向红色正极跑），加入1xtae缓冲液，使其完全浸没（高出胶2-5mm）琼脂糖凝胶h将pcr扩增产物加入加样孔中，每个孔2ul（前两个孔空出，第三个孔加marker，之后加空白对照，再之后是实验组），加样过程中尽量快且准减少产物扩散i盖上板子，接好电源，调整电压时间（100v，40min），启动仪器，开始跑胶j当黄色到达琼脂糖凝胶边缘时即可停止，关闭仪器，取出凝胶，放入凝胶成像仪中观察结果（4）硫酸铵沉降法粗提肠球菌素a 菌液活化后按2%接种在优化后的培养基中，以最优条件培养，将培养好的菌液10000r/min，4℃离心15min后，用饱和度80%的硫酸铵溶液处理，4℃下磁力搅拌12h，10000r/min，4℃离心10min，将沉淀溶于1/40体积的dd水中，分别测定沉淀复溶液与盐析上清液的抑菌圈直径，确定硫酸铵溶液的最佳饱和度。
4. 研究创新点
目前，关于乳酸菌细菌素的研究并不深入，对于具体的结构性质尚且模糊，而对屎肠球菌B1所分泌的肠球菌素A的研究更是少之甚少，而该菌通过其代谢产物可以对单增李斯特菌等多种革兰氏阳性致病菌有很好的抑制作用，因此其具有很高的商业与应用价值，本课题在前人研究的基础上，通过一系列的提取鉴定手段，对屎肠球菌B1的细菌素进行深入的研究，增加对其生理现象与机制的理解，进一步丰富当前现有的研究成果，是本项目的创新之处。
5. 研究计划与进展
2017/7/1 - 2017/9/1: 查阅文献、收集资料，制定详细研究计划，进入实验室熟悉实验条件、学习相关实验技术；2017/9/1 - 2017/10/1: 进行预实验，大致了解整个试验过程并对可能出现的意外状况做好防范措施，为正式实验打下基础；2018/3/1 - 2018/4/1: 进行正式实验；2018/4/1 - 2018/5: 整理结果，完成毕业论文，准备答辩。
