1. 研究目的与意义
一、毕业设计内容
本实验的研究内容主要是为构建淫羊藿黄酮仿生酶解口服给药系统提供前期研究基础。体外采用caco-2细胞模型，模拟淫羊藿黄酮苷（淫羊藿苷、朝藿定a、朝藿定b、朝藿定c）与蜗牛酶共存体系在体内的转运吸收过程。
2. 文献综述
淫羊藿黄酮肠道吸收的研究进展
牛泽元1
（1.南京中医药大学翰林学院，江苏 泰州 225300）
3. 设计方案和技术路线
一、研究方案
1、 Caco-2细胞单层模型的建立：将Caco-2细胞复融后置于75 cm2的卡式培养瓶中，在37℃二氧化碳培养箱中 (5%CO2，相对湿度95%)培养，每隔一天换一次培养液，以DMEM ( Dulbecco's Modified Eagle's Medium ) 为培养液(含10%胎牛血清(FBS)，1%非必需氨基酸(NEAA)，1%谷氨酰胺(L-glutamine)，青霉素(100 UmL 1)-链霉素(100 ugmL 1)双抗液)。当细胞生长至约80%融合时，用胰蛋白酶消化液消化传代将Caco-2细胞混悬液接种于预先用鼠尾胶原处理过的Transwell培养板的多聚碳酸酯膜上，接种密度为(100,000细胞/cm2)，单层细胞于19 ~ 21天左右分化形成，用跨膜电阻仪检测跨膜电阻值(TEER)，各孔跨膜电阻值均大于空白对照值250 ohm/4.2cm2以上，即符合实验要求可用于试验。
2、 转运实验：用37℃ 预热的HBSS 溶液(pH 7.4)洗涤细胞单层3次，测定跨膜电阻，弃去跨膜电阻值小于250 Ωcm2 的部分。将预热的HBSS溶液加入余下符合转运的部分中，置于摇床(37℃)孵育1小时后将HBSS溶液吸弃。对于药物从细胞绒毛面顶端侧(AP)→ 基底侧(BL)的转运：将试药溶液2.9 mL加到AP(供给池)侧，同时将2.5 mL空白HBSS溶液(pH 7.4)加到BL(接收池)侧；对于药物从基底侧(BL)→顶端侧(AP)的转运：将试药溶液2.9 mL加到BL(供给池)侧，同时将2.5 mL空白HBSS溶液加到AP(接收池)侧。将加好溶液的Transwell六孔板置于恒温摇床中孵育(50 rmin-1、37℃)，分别在0、1、2、3、4 h时于供给池、接收池侧各吸取溶液400 μL，之后用相应的溶液补足。实验结束后测定其电阻值，设平行操作3次。
3、 样品的处理：精密吸取供给侧或接收侧中的样品溶液400 μL，立即加入100 μmolL-1的睾丸酮内标溶液100 μL，于高速离心机中以13000 rmin- 1的转速离心15 min。吸取上清液用Agilent 1260高压液相色谱仪进行分析。
4、 数据处理:药物表观渗透系数Papp的计算公式如下：
其中，dM/dt代表药物的转运速率(cms-1)，S代表Transwell膜面积(4.2 cm2)，C代表药物初始浓度(μmolL-1)。
二、技术路线
Caco-2细胞转运模型 |
淫羊藿黄酮苷与蜗牛酶共存体系（黄酮苷 蜗牛酶：1:1/w:w） |
淫羊藿黄酮苷的酶解，酶解产物的生成 |
淫羊藿黄酮苷以及酶解产物转运 |
淫羊藿黄酮在蜗牛酶存在的情况下达到实时酶解，实时吸收 |
酶解、转运数据收集与分析 |
4. 工作计划
2022.12-2022.1查阅相关文献，提供理论基础
2022.1-2022.2淫羊藿苷 蜗牛酶caco-2细胞转运试验
2022.2-2022.3朝藿定a 蜗牛酶caco-2细胞转运试验
5. 难点与创新点
本课题采用Caco-2细胞模型模拟了淫羊藿黄酮苷与蜗牛酶共存体系在体内的转运吸收过程，为评价仿生酶解口服给药系统的有效性和科学性提供数据支持。
