菲牛蛭Guamerin基因的克隆和吸食对其表达的影响开题报告

1. 研究目的与意义

1、本课题的意义

水蛭，我国一味传统的活血化瘀中药，药用部位为干燥虫体，具有破血、逐瘀、通经的功效，具有较好的抗血栓、抗凝血以及改善血液流变学等作用，临床上用于治疗血瘀证。 目前已知水蛭中的抗凝成分主要为一些小分子肽类, 其中以欧洲医用水蛭中所含有的水蛭素研究最为透彻。本实验将水蛭的不同组织部位，以及在不同吸食阶段的水蛭的各个组织部位的水蛭素基因通过RT-PCR进行定量分析，探究吸食对水蛭水蛭素基因表达的影响，同时有利于确定水蛭水蛭素基因的最佳时空表达模式。

2、国内外研究概况、应用前景等

水蛭是环节动物蛭纲类，俗称蚂蟥，学名水蛭，是我国的一种传统中药，2000 多年前的《神农本草经》中就有描述。《本草纲目》谓其：咸走血，苦胜血。水蛭之咸苦，以除蓄血，乃肝经血分药，故能通肝经聚血。中医认为水蛭是一种传统的破血药，有逐瘀、通经脉、利水道的功效，主要用于治疗血瘀经闭、中风偏瘫、跌打损伤等疾病。现代中医应用水蛭治疗的临床疾病主要有：慢性肾炎、静脉曲张，前列腺炎、不孕及抗早孕、糖尿病、癌症、心脏病、肝硬化、高血压、高血脂症、脉管炎、女子血闭、结膜炎与白内障、哮喘病等。水蛭体内含有水蛭素、组胺样物质、肝素、抗血栓素等多种药用成分，对消除手术后引起的后遗症、阻碍血液凝固、促进血液循环有重要作用。多年来学者们利用水蛭研发各种药物，并取得了显著的效果。相信随着对水蛭医用研究的越来越广泛，对水蛭化学成分、药理作用及临床应用的日益深入，水蛭将为我们的健康做出不可低估的贡献。

抗凝、抗血栓作用：翟新艳通过实验研究表明，水蛭的提取物可以延长小鼠凝血、出血时间来说明水蛭的提取物具有抗凝作用。水蛭素同凝血酶的亲和能力相当强，其与凝血酶的中和可以在低温高速环境下进行。动脉粥样硬化主要是血小板聚集引起的，而凝血酶是激活血小板的重要物质，水蛭素与凝血酶的结合刚好可以抑制血小板聚集，起到治疗的目的。李艳玲等经过抗凝血实验表明不同炮制方法不同提取液的抗凝效果不同，其采用大鼠体外活性实验结果表明，水蛭的乙酸乙酯层抗凝效果最好，然而正丁醇层、正己烷层也都存在着不同程度的抗凝血作用。

抗肿瘤作用：大量的试验研究表明水蛭可以通过影响肿瘤细胞的黏附穿膜能力，抑制凝血酶的作用，抑制血小板聚集等方面来体现其抗肿瘤作用。王杰、张博等利用复方水蛭素治疗小鼠异体移植的W256肿瘤和接种S180瘤细胞的小鼠的研究表明，复方水蛭素可以明显降低W256肿瘤细胞和小鼠移植瘤细胞p53、Ki267及VEGF的表达，能抑制肿瘤细胞的生长。于瑞发等研究发现水蛭提取物对小鼠移植性肿瘤具有较强的抑制作用，同时能使免疫能力得到改善。方圆通过研究水蛭对肝癌HepG2细胞转化酶的影响得出其能抑制肝癌细胞的DNTMs表达。

抗细胞凋亡作用：近年来实验研究表明，水蛭对脑细胞、肝细胞、肺细胞等均有保护作用。吕莉等观察水蛭素对右侧大脑中动脉阻塞(MCAO)模型的影响，研究结果提示，高剂量水蛭素具有明显的抗脑缺血作用，且效果较银杏叶明显，同时对神经元细胞凋亡具有明显的抑制作用。陈姝等的研究结果表明，水蛭桃仁煎剂可以抑制小鼠肝细胞的凋亡。王洋等通过药理实验表明水蛭具有抗肺细胞凋亡的作用。

抗炎、抗纤维化作用：鲍宗麟等通过对慢性病毒性肝炎患者的临床观察研究得出，水蛭对慢性病毒性肝炎有很好的治疗作用。孙学强等通过对30名肝硬化患者进行临床观察结果表明，水蛭有助于提高中药复方合剂抗肝纤维化的治疗效果。林建明等在研究水蛭对狼疮性肾炎患者的作用时发现，水蛭对肾炎患者有一定的拮抗作用，改善肾功能等。杨影等研究发现，水蛭素可以有效降低纤维细胞的增殖率。

随着科学技术的日益发展，人们对水蛭的研究日趋深入，研究领域日趋扩大，其药理作用正在被更多的挖掘出来并为人们所利用，水蛭具多种药理活性，作为一种传统的活血祛瘀药，被广泛用于临床，特别是在中药现代化进程中，水蛭的广泛药理药效作用越来越使其成为预防、治疗多种疾病的重要药物，其应用前景广阔。通过对水蛭的全面深入的研究，能使水蛭这一传统的中药焕发出新的活力，扩大其防治疾病的领域，更好的为人类的健康服务。

3、主要参考文献

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2. 研究内容和预期目标

当今血栓性心脑血管疾病已成为威胁人类健康的大敌,探索和研究有效防治此病的药物是一项十分紧迫的任务 ,无论在临床应用还是基础研究方面都具有重大意义。为了促进药物效果更好，副作用更低的抗凝药物的出现，需要对未知的抗凝基因进行寻找，对于已知的抗凝基因要有更深入的研究，探究适合其表达的时间空间水平。

本课题研究内容是研究影响抗凝基因表达的因素，主要研究吸食对抗凝基因表达的影响，本实验将水蛭的不同组织部位，以及在不同吸食阶段的水蛭的各个组织部位的水蛭素基因通过rt-pcr进行定量分析，探究吸食对水蛭的水蛭素基因表达的影响，同时有利于确定水蛭的水蛭素基因的最佳时空表达模式。

拟解决的关键问题

3. 研究的方法与步骤

研究方法

运用定量分析法，定性分析法，比较法及综合分析法等方法进行研究。

技术路线见附件

4. 参考文献

本课题首次研究吸食对水蛭抗凝基因表达的影响，研究成功可以根据需要调整水蛭吸食情况，从而获得最佳抗凝基因，提高临床疗效的质量标准。

5. 计划与进度安排

（1）2022.2.1-2022．3.1

查文献，写文献综述和开题报告

（2）2022.3.1-2022.3.30