蚂蟥组织单细胞制备的研究开题报告

1. 研究目的与意义

本课题的意义、国内外研究概况、应用前景等（列出主要参考文献）

本课题以宽体金线蛭蚂蟥（whitmania pigra whitman）为研究对象。蚂蟥是传统中药水蛭的基原动物之一，其干制品炮制后入药，具有破血通经、逐瘀消癥的功能，历来用于治疗血瘀闭经、症瘕痞块、中风偏瘫、跌打损伤^[1]。

目前国内外对蚂蟥的研究主要集中在其药材水蛭的药理作用、化学成分、临床作用等方面。在基原动物生物学研究方面，主要集中在日本医蛭、菲牛蛭等吸血蛭类的遗传特性^[2]、资源调查^[3]、消化道酶^[4]、细胞与神经传导^[5]、摄食机理^[6]等方面的研究。对蚂蟥等非吸血蛭类的研究资料相对较少，主要集中在对蚂蟥遗传多样性^[7-8]、呼吸生理^[9]、消化生理^[10]、组织结构^[11]、内在品质^[12]以及进化^[13]等方面的研究报道。水蛭中含有大分子类化合物，如水蛭素、肝素、组织胺、吻蛭素和氨基酸等；也含有糖脂类、蝶啶类、甾体类和羧酸酯类等多种小分子类物质。其药理作用主要有抗细胞凋亡、抗肿瘤、抗凝、抗血栓、抗炎、抗纤维化等^[14]。

2. 研究内容和预期目标

研究的目标、内容和拟解决的关键问题

研究目标

3. 研究的方法与步骤

研究方法、技术路线、实验方案及可行性分析

研究方法

1.先探究可行的机械方法将大块组织转变为可供称量和酶解的小块组织，以便组织能与胰蛋白酶溶液充分接触，再通过酶解分散组织，以获取单个细胞。

2.控制变量法考察主要影响因素分别为胰蛋白酶浓度和酶解时间时对两种组织酶解过程及结果所产生的作用及影响（即单因素试验）。

3.正交试验法分别探究两种组织单细胞制备的最佳酶解条件。

技术路线

实验方案

一、通过单因素试验，分别以胰蛋白酶浓度、酶解时间作为单一变量，进行实验探究。

1.胰蛋白酶浓度

分别以0.1、0.2、0.25、0.3、0.4的胰蛋白酶浓度，在37℃、pH约7.2（PBS）的条件下水解10分钟，终止水解后，过滤离心，加磷酸缓冲液得细胞悬浮液，并及时进行细胞计数。

2.酶解时间

两种组织分别在其最适胰酶浓度下进行水解，pH7.2、温度37℃条件下，分别水解5分钟、10分钟、20分钟、30分钟、60分钟，终止水解后过滤离心，加入磷酸缓冲液制得细胞悬浮液，并及时进行细胞计数。

二、在单因素试验基础上设计正交试验。

以胰酶浓度、酶解时间为变量，设计两因素三水平的L9正交试验。

表1 消化道组织胰酶x时间正交设计

表2 肌肉组织胰酶x时间正交设计

可行性分析

1.本课题研究目的明确，具有清晰的试验思路及操作流程。

2.本课题主要涉及的试验操作清晰，较为简单。试验仪器简单，全部具备，学生基础理论知识扎实，实验操作技能曾在各实验课程及SRT中得到过训练。故课题实验具有很强的可操作性。

3.本课题所需实验材料蚂蟥可由相关基地提供，实验方案明确，大四课程较少，学生有充裕的时间进行实验研究。

4.此课题的指导老师郭巧生教授经验丰富，具有丰富的蚂蟥研究基础，曾多次在核心期刊上发表相关文章，能给予学生较好的指导。

4. 参考文献

特色或创新之处

之前未见有关蚂蟥细胞制备及细胞培养方面的文献报道，本课题对蚂蟥的组织进行酶解制备单细胞悬浮液属首次尝试，摸索其最佳制备条件可为今后的单细胞研究打下基础；所得单细胞悬浮液也可后续研究其药理药效，为动物药水蛭的资源开发提供新的思路。

5. 计划与进度安排

研究计划及预期进展

2022.12 查阅与课题相关的文献与方法，初步制定实验方案。

2022.1练习解剖蚂蟥，获取较为纯净的组织；探究前期材料预处理方法，确定行之有效的将大组织块转变为小组织块的方法，。