1. 研究目的与意义、国内外研究现状（文献综述）
| 本课题的意义国内外研究概况应用前景等(列出主要参考文献) 1.本研究意义及研究进展 我国城乡面临大面积土壤重金属污染的严重生态安全问题据报道,全国城市约40%的待绿化土地乡村约有16%的土壤存在重金属超标问题,治理和利用这些受污染的土地资源已成为国家发展战略中的重点攻关方向草坪草分布范围广,适应能力强,不仅具有美化环境功能,同时能通过根系固定和吸收土壤重金属及地上部修剪带走重金属,是重金属污染地区绿地建设和生态建设中的适宜植物种类,应用前景广阔重金属镉(Cd)是目前污染最为严重及生物毒性最强的元素之一,低浓度的土壤镉胁迫就能显著抑制草坪草生长(Lou et al. ),降低草坪质量如何在镉污染的土地上建植草坪并保持较高的草坪质量?耐镉草坪草新种质的培育利用是解决这一问题的根本途径而解析草坪草在镉胁迫下的生理及分子响应机制,对草坪草耐镉定向育种具有重要指导意义 海滨雀稗(Paspalum vaginatum)属禾本科雀稗属多年生盐生草本植物,原产于热带亚热带海滨地带,分布于南北纬°以内的沿海地区,是优异的多年生暖季型草坪草,在园林绿化运动场建造及盐渍地改良中广泛应用现有研究表明,海滨雀稗是暖季型草坪草中耐镉性最强的草种,其土壤耐镉阈值显著高于假俭草结缕草和杂交狗牙根(王凯 2010;张辉 2012)因此,海滨雀稗可以作为草坪草耐镉机理研究的理想材料然而,目前关于草坪草的耐镉胁迫研究仅涉及耐镉评价和生理层面,其耐镉分子机制报道甚少 ABCC(MRP)转运蛋白最初被鉴定为位于液泡上的转运GS扼合物的离子泵,并推测有可能参与其他生理过程,如细胞内的解毒作用叶绿素代谢物的运输以及离子通道的调节等[]（Behrens et al., 2019）Song等在研究植物对于重金属砷的解毒机制时,鉴定AtABCC/AtMRP和AtABCC/AtMRP是一类十分重要的定位于液泡膜上的PCs(金属螯合物)转运蛋白,过量表达该基因可提高植物对砷的耐受性;同时,它们也介导了细胞对镉和汞的耐受性[]（Park et al., 2012）Brunetti等（2015）的最新研究表明AtABCC能够介导PC-Cd复合体的运输,同时其活性受镉的调控,并与AtABCC和AtABCC的活性协调一致,AtABCC是否参与植物对砷或其他重金属的耐受还有待研 究Gaillard等（2008）发现AtMRP在拟南芥幼苗发育的早期表达,在重金属镉胁迫下 |
| 表达上调, 意味着AtABCC/AtMRP参与重金属的解毒作用指导老师课题组前期通过 转录组和蛋白组差异分析,发现了一个海滨雀稗ABCC转运体家族成员PvABCC基因受镉胁迫上调表达由此,本研究将进一步克隆海滨雀稗PvABCC基因并检测其在镉胁迫下的表达模式,通过酵母异源表达初步分析其耐镉功能 参考文献 [1] 王凯 (2010) 假俭草和海滨雀稗对土壤 Pb、Cd、Zn 污染胁迫的响应及耐受阈值研究. 上海交通大学硕士学位论文 [2]张辉 (2012) 暖季型草坪草对土壤镉的耐受阈值与富集能力的研究. 上海交通大学硕士学位论文 [3] Behrens, C.E., Smith, K.E., Iancu, C.V., Choe, J.Y. and Dean, J.V. (2019) Transport of Anthocyanins and other Flavonoids by the Arabidopsis ATP-Binding Cassette Transporter AtABCC. Scientific reports,9,437. [4]Park, J., Song, W.Y., Ko, D., Eom, Y., Hansen, T.H., Schiller, M., Lee, T.G., Martinoia, E. and Lee, Y. (2012) The phytochelatin transporters AtABCC and AtABCC mediate tolerance to cadmium and mercury. Plant Journal,69,278-288 [5] Brunetti, P., Zanella, L., De Paolis, A., Di Litta, D., Cecchetti, V., Falasca, G., Barbieri, M., Altamura, M.M., Costantino, P. and Cardarelli, M. (2015) Cadmium-inducible expression of the ABC-type transporter AtABCC increases phytochelatin-mediated cadmium tolerance in Arabidopsis.Journal Of Experimental Botany,66,3815-3829. [6] Gaillard, S., Jacquet, H., Vavasseur, A., Leonhardt, N. and Forestier, C. (2008) AtMRP/AtABCC, an ATP-Binding Cassette transporter gene expressed during early steps of seedling development and up-regulated by cadmium in Arabidopsis thaliana. Bmc Plant Biology,8. |
2. 研究的基本内容和问题
| 研究的目标内容和拟解决的关键问题 1.研究目标 l 获得海滨雀稗ABCC3转运体ABCC3基因全长序列,通过生物信息学软件初步解析其蛋白质序列。 l 海滨雀稗的达模式分析。 l 酵母异源表达分析其耐镉性。 2.研究内容 l 克隆获得海滨雀稗PvABCC3序列,并进行聚类分析 课题组前期通过海滨雀稗转录组和蛋白组差异分析,发现了两个海滨雀稗ABCC3转运体ABCC3基因受镉胁迫上调表达通过PCR扩增技术克隆获得PvABCC3序列,并与水稻ABCC类家族蛋白进行进化树分析 l 海滨雀稗的表达模式分析 500μM CdCl2处理下,取不同时间点的海滨雀稗的根茎叶,提取植物的总RNA,反转录出cDNA,通过对比cDNA间含量差异来检测海滨雀稗PvABCC3的相对表达量 l 酵母异源表达下耐镉性鉴定 将海滨雀稗PvABCC3通过酵母快速转化试剂盒异源转化酵母Δycf1,在不同CdCl2浓度下分析其耐镉性 3.拟解决的关键问题 l 海滨雀稗PvABCC3是否参与调控了海滨雀稗的耐镉功能 课题组前期分析转录组和蛋白组数据时,发现其可能参与植物耐镉调控我们需要通过生物信息学分析表达模式分析和酵母异源表达的耐镉鉴定来初步解析是否参与调控了海滨雀稗的耐镉功能。 |
3. 研究的方法与方案
| 研究方法技术路线实验方案及可行性分析 1.实验方案 (1)海滨雀稗PvABCc的生物信息学分析(已完成): 根据转录组和蛋白组的数据,搜索海滨雀稗转录组库,设计PvABCC3的引物序列,再通过PCR克隆和测序确定其序列,并和水稻ABCc家族进行进行聚类分析 (2)海滨雀稗PvABCC3的定量表达分析: 首先将海滨雀稗‘Sea Spray’野生型进行扩繁,获得足够的实验材料,采用水培方法， |
| 选取生长一致的顶端茎段(约4-5cm)水培至生根,然后采用500μM CdCl2,分别于0h3h6h12h和24h,取0.1g新鲜根茎叶提取总RNA,反转录,检测海滨雀稗PvABCc基因的相对表达量,4个生物学重复 (3)酵母异源表达分析耐镉表型 将基因构建到酵母表达载体pGAD上,异源表达酵母突变体Δycf,在 和 Mm CdCl2浓度下分析其耐镉性 2.技术路线
3.可行性分析 l 拥有成熟的研究材料,海滨雀稗是优异的暖季型草坪草,具有很强的耐镉性本研究具有选材的科学性
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| l 实验条件有保障,所在本课题组拥有完成此项目的所有仪器设备,为本实验的顺利实施和完成提供了完备的硬件条件 l 本课题前期在转录组文库中已获得PvABCc全长序列,为本研究的顺利开展提供了必要的物质基础 l 指导老师具有丰富的分子生物学研究经历,在指导老师的精心指导下,相信有能力取得预期的调查结果 |
4. 研究创新点
特色或创新之处
目前仅发现拟南芥AtABCC1AtABCC2AtABCC3和AtABCC5参与了重金属的转运,起到一定解毒作用海滨雀稗PvABCC3是否参与耐镉调控,尚不清楚通过对PvABCC3功能的初步解析,可进一步了解草坪草耐镉生理及分子机制,是实现草坪草耐镉定向育种的关键前提,具有一定的新颖性5. 研究计划与进展
| 研究计划及预期进展 1.研究计划 l 2018.9-2018.12: 海滨雀稗材料培养基因克隆和载体构建; l 2019.1-2019.3 :定量表达分析,生物信息学分析; l 2019.4-2019.5 :酵母异源表达耐镉功能鉴定,完成课题 2.预期进展 l 初步解析海滨雀稗PvABCC3基因的耐镉功能 |
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