珊瑚菜非特异性磷脂酶C(GlNPC1)蛋白活性分析开题报告

 2023-02-20 09:02

1. 研究目的与意义、国内外研究现状(文献综述)

1、选题的目的和意义:

珊瑚菜(glehnia littoralis fr. schmidt ex miq.)为伞形科珊瑚菜属多年生草本植物,以其干燥根入药,称为北沙参,味甘甜,属滋阴药,具有清肺化痰、养阴润燥、益胃生津的功效。野生珊瑚菜的主要分布区是沿海,对该地的防风固沙和改良盐碱土具有重要作用。但是由于近年来人们的过度开采,野生资源越来越少,面临着枯竭的危险。因此,当前国内市场销售的北沙参基本为栽培品,其主要产区是内蒙古地区,从珊瑚菜的生长发育环境可以推知,珊瑚菜具有优良的抗盐以及抗旱特性,但有关珊瑚菜抗盐机理的研究还不透彻,本课题主要针对与珊瑚菜抗盐机理相关的磷脂酶进行研究。

2、国内外研究现状:

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2. 研究的基本内容和问题

1、研究的目标:

构建glnpc1蛋白表达载体;

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3. 研究的方法与方案

1、研究方法

PCR扩增、测序比对、提取质粒、转化、小摇、大摇、提取纯化蛋白、测试四种底物的水解活性

2、技术路线图

3、实验方案:

(1)PCR扩增

上游引物序列:CCGATAACGC TGTACCTCGTAGTGCACATT CCTTTAACGC TTCAAAATCT GTAAAGCACG CCATATCGCC GAAAGGCACA CTTAATTATT AAGAGGTAATACACCATGAA TCACAAAGTG CATCATCATC ATCATCATAT CGAAGGTAGG CATATGGAGC TCGGTACCCTCGAGGGATCC GAATTC

下游引物序列:GAATTCAAGCT TGTCGACCTGCAGTCTAGAT AGGTAATCTC TGCTTAAAAG CACAGAATCT AAGATCCCTG CCATTTGGCG GGGATTTTTTTATTTGTTTT CAGGAAATAA ATAATCGATC GCGTAATAAA ATCTATTATT ATTTGAAGAA TACTGG

(2)测序比对

(3)提取质粒:提质粒,将PCR产物连接到质粒上并检验

(4)转化:先打好碎冰,在-70℃中取出感受态细胞(BL21表达用/DH5α克隆用),质粒1μl打入感受态细胞中轻打匀,在冰上放30min;

42℃水浴锅中热激1min30s;

热激后迅速放入冰上2min;

在无菌操作台上,每个管子里加入800微升的培养基LB(空培养基,不加抗生素,复苏用);

37℃摇床复苏1h;

倒平板培养,倒一半即可,不要都涂,倒置封好,培养箱过夜;

将单菌落划板培养并进行PCR扩增验证

(5)小摇:

转化后菌用牙签接入20ml的加入氨苄抗生素(氨苄与卡纳母液都是50mg/ml,卡纳稀释1000倍用,氨苄稀释500倍用)的LB培养基,200转37℃摇床过夜;

准备好第二天要用的LB培养,配好灭菌;

(6)大摇:

大摇瓶加氨苄抗生素,1:50(1ml菌加入50ml培养基)用枪转移,200 rmp 37℃大概摇2h,取一毫升到圆头空管里,分光光度计测OD值为0.8—1左右,600纳米下,要稀释测,一毫升菌加两毫升水,稀释三倍,测出的OD值乘3即可。

菌液加IPTG诱导,22℃摇床培养,摇6h,160 rmp;

收菌,50ml离心管离心5000g,5min;

(7)提取纯化蛋白

(8)蛋白电泳检验

(9)配置水解反应体系

(10)测试四种底物的水解活性

(11)超声破碎一分钟,将两相混合均匀后,分装在1.5ml的小管子中,做好标记,每管分别加入定量蛋白;

(12)提前将水浴锅调至37℃,将管子在水浴锅中加热避光反应;

(13)反应结束后放在冰上,每500μl酶液加入1000μl氯仿:甲醇=1;2(v/v),和750μl 0.45%的NaCl;

(14)离心12000g 5min,吸取下层有机相(含DAG),用氮气吹干,加入氯仿:甲醇=2:1 50μl每管;

(15)硅胶板烘干 30min,准备展层剂

A:石油醚:乙醚:乙酸=50:50:1

B:甲苯:氯仿:甲醇=85:15:5

C:正丁醇:乙醚:乙酸=70:30:1

(16)点样,跑薄层

(17)刮板子,过夜萃取

(18)用酶标仪测其活性

4、 可行性分析:

(1)实验所需要的PCR仪,超声破碎仪,离心机,IPTG诱导剂等试剂以及设备均具有;

(2)根据查阅的相关资料以及相关老师的指导,实验设计具有文献参考,方法合理因此可以开展此课题。

4. 研究创新点

特色或创新之处:

珊瑚非特异性磷脂酶c在参与响应盐胁迫过程,其在如何起作用是研究重点,而分析其水解活性是进行酶功能研究的基础,并能够丰富植物中磷脂酶c的研究。

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5. 研究计划与进展

1、研究计划:

2019.7-9:

已知目的基因序列的情况下进行pcr扩增

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