D-乳酸固定化发酵载体优化初步研究开题报告

1. 研究目的与意义（文献综述包含参考文献）

文献综述

1.1乳酸简介

乳酸的学名为α-羟基丙酸，分子式为C2H5OCOOH,是一种天然存在的有机酸，广泛存在于人体、动物、植物和微生物中[1]。乳酸是自然界最小的手性分子，分子中羧基A位碳原子为不对称碳原子，具有L( )和D(-)两种构型。L-乳酸为右旋型，D-乳酸为左旋型，L-乳酸和D-乳酸等比例混合即为消旋的DL-型。D-乳酸和L-乳酸除旋光性外，它们的其它理化性质相同[2]，但DL-型的物理性质与它们有所差别，表现在其熔点和熔化热比单一D或L构型的低。

1.2D-乳酸发酵研究现状

微生物发酵法是目前制备乳酸的最主要方法之一。发酵法根据菌种不同可得到L-乳酸、D-乳酸。D-乳酸的理化性质与L-乳酸极其相似，在生产工艺上可以借鉴L-乳酸成熟的路线[3]。目前国内外研究较多的产D-乳酸乳酸菌主要集中在乳杆菌属和芽孢乳杆菌属。这两个属的菌都属于典型的同型发酵菌，专性或兼性厌氧，产量高，适合大规模化发酵生产。

乳杆菌属是乳酸工业发酵的传统优势菌种，这是由于其自身具有显著的特点：合成的乳酸高浓度、对乳酸耐受性高、生产速度快等。Calabia等报道了L.delbrueckiiJCM1148利用甘蔗糖蜜、甘蔗糖汁及甜菜汁等农业废弃物做为发酵的碳源产D-乳酸，浓度分别为107，120和84g/L，光学纯度为98.3%[4]。Joshi等报道了一株L.lactisNCIM2368的突变菌可以利用蔗糖发酵产D-乳酸，终浓度达110g/L，光学纯度98%[5]。Li等报道了S.laevolacticusDSM442利用棉籽粕做为氮源发酵产D-乳酸，得到144.4g/L的D-乳酸，光学纯度达99%[6]。Wang等报道了用S.inulinusCASD做为D-乳酸生产菌，用葡萄糖做碳源，同步酶解花生粕最终获得207g/L的D-乳酸[7]。Zhang等人利用L.delbrueckii采用纸浆和玉米秸秆的水解液等廉价碳源发酵产D-乳酸，终浓度达36.3g/L，光学纯度达99.8%[8]。

1.3固定化微生物技术

20世纪70年代后,固定化微生物技术才直接从固定化酶技术发展而来[9]。固定化微生物技术是用化学或物理手段将游离微生物定位于限定的空间区域,以提高微生物细胞的浓度,使其保持较高的生物活性并反复利用的方法[10]。由于该技术既不需要把酶从细胞中提取出来,又不需要加以纯化,因而酶活性损失小。一般来说，有4种固定化技术，即附着（吸附），包封，密封和自聚集（如图1所示）[11]。

从工业角度来看，细胞固定化方法[12]已成为提高发酵罐中的细胞浓度的最有用的方法之一，这将得到更高的乳酸生产率。此外，相对于传统发酵，应用固定化细胞可提高细胞自身及运行的稳定性，降低了对氮源的需要，可以使用再利用，降低了耦合发酵和分离过程的下游加工，并且由于使用高浓度的细胞从而减少污染的风险[13]。此外，连续发酵可以在高稀释率下进行操作。

1.4固定化载体的选择

制备固定化细胞就是利用各种载体将细胞固定起来，因此，选择理想的载体在固定化细胞技术中是十分关键的。

一般而言，选择载体的标准[14]是：对细胞无毒性；不影响活细胞的新陈代谢；能增加细胞通透性或增强细胞代谢；载体固定化细胞的容积大，即有较高的细胞负载和活性。在实际应用中，载体容量一般用每克载体中的细胞个数（个/g）来表示。

目前用于固定化的载体[15]可以分为两类：有机物和无机物。每种载体都有他自身的优势，但大多数人所认可的一般是有机载体，因为它们的表面可以提供更多的反应基团，如：氨基、羧基、羟基、咪唑基等。

有机载体可以分为多糖类载体、蛋白质载体和合成多聚物载体等。根据亚基的类型，多糖类载体可再进一步分成纤维素及其衍生物、葡聚糖或琼脂糖；合成多聚物可分为丙烯酰胺多聚体、酚和甲醛共聚体（酚树脂）、苯乙烯和二乙烯苯共聚物。

无机载体包括各种氧化物及其化合物的无机材料，具有高度热稳定性和良好的流动性，无机载体又可以分为非枝接载体和枝接载体，在溶液中，非枝接载体表面被水解后形成的羟基可以直接和细胞表面的羧基和氨基反应，而枝接载体在无机载体的表面接上特殊的有机基团。

表1微生物载体分类

不同的细胞固定化方法所需要的载体也不同。如下：

⑴吸附法是利用各种固体吸附剂将细胞吸附在其表面而使细胞固定化，所使用的载体都是水不溶性的，如：硅藻土、多孔陶瓷、多孔玻璃、多孔塑料、离子交换树脂、活性炭、硅胶、高岭土、中空纤维等。谢冬瑾等[16]研究了不同的固定化方式、吸附载体及载体体积对吸附法固定化白腐真菌的影响，载体选择预处理的稻草秆粉末、棉花秆粉末、麸皮、花生壳粉末、木屑、玉米芯、丝瓜囊等农业废品及活性炭，固定化方式采用直接吸附和先培养后吸附两种吸附方式，以降解模拟废水后测定苯酚含量和COD去除率为判断标准，得到如下结论：(1)将载体直接加入接种了白腐真菌的培养基时的固定化效果优于将载体加入已培养好的白腐真菌悬浊液之中，此法16h时苯酚去除率达到100%，COD去除率约为97%。(2)以所选择的8种材料为载体所得固定化白腐真菌对模拟废水降解效果均较好，丝瓜囊为最佳载体。丝瓜囊固定化的白腐真菌15h时对苯酚的去除率为100%；18h时对COD的去除率达到98.7%。(3)载体体积对COD和苯酚去除率的影响不同,粉末状载体在提高苯酚降解率的同时导致COD降解率略为降低。12h时花生壳粉末对苯酚去除率达到100%，此时花生壳对苯酚去除率仅为85%；21h时花生壳对COD去除率达到100%，而花生壳粉末约为95%。

⑵包埋法就是将细胞包埋在多孔载体内部而形成固定化细胞，可以分为凝胶包埋包埋法和半透膜包埋法。凝胶包埋法是使用最广泛的包埋法，它所使用的载体主要有琼脂、海藻酸钙凝胶、角叉菜胶（也称作卡拉胶）、明胶、聚丙烯酰胺凝胶和光交联树脂等。

⑶交联法制备固定化细胞是利用双功能或多功能试剂与细胞表面的基团发生交联形成网格状结构而制成固定化细胞，这是一种不用载体进行细胞固定化的仿方法，常用的交联剂有戊二醛、顺丁烯二酸酐、甲苯二异氰酸酯等。

⑷微囊化为细胞创造了一个微生态环境，有利于保护细胞。通过生物微胶囊固定化培养，使培养过程与分离过程有机的结合起来，充分体现了生物微胶囊固定化的优势，其中微囊包被材料为细胞提供保护性环境，因而膜材料化学成分将直接影响微囊的生物相容性和物理稳定性。目前以海藻酸钠、聚赖氨酸、海藻酸钠(APA)微囊技术发展最为成熟。研究发现，海藻酸的纯度与微囊的生物相容性直接相关[17]。金属有机物[18]，硅化微晶纤维素[19]等新型的微囊化材料也在实验室规模取得了一定的成功。在对微囊的形态进行重新设计的过程中，Yamamoto等人设计了微囊与中空纤维膜相结合的新型微囊化技术和反应器[20]，中空纤维减小了气体传质对微囊的损伤，增加了整体的稳定性,取得了较好的效果。

⑸共价法是利用细胞表面的反应基团，如：氨基、羧基、羟基、巯基、咪唑基等，与载体通过化学反应形成共价键来实现细胞的固定化。共价法常用载体有无机载体和有机载体，无机载体包括活化的玻璃、陶瓷等；有机载体包括琼脂、纤维素、骨胶原等。

⑹微生物细胞自絮凝进行细胞固定化是利用一些菌株自身具有的强絮凝能力自身形成固定化颗粒，此法是一种无载体的固定化方法，通常是在细胞生长期间发生的无性凝集。

⑺膜截留固定化利用细胞不能透过半透膜等而产物和底物可以通过的性质，通过半透膜、中空纤维素、超滤膜等截留。这种方法常用于制备生物传感器和膜反应系统。

尽管固定化方法多种多样，但没有一种理想的、普遍适用的方法，适用于某一菌体的固定化方法不一定适用于其它菌体。因此，目前的状况是：各研究者根据自己所选择的菌种和使用情况，进行固定化方法、固定化载体及固定化条件的选择与改进。表2是几种固定化方法的比较。

表2几种固定化方法及其特性的比较

1.5固定化发酵有机酸研究现状

目前，固定化发酵D-乳酸的研究比较少，但是可以借鉴其他有机酸固定化发酵的研究来展望固定化发酵D-乳酸的前景。

韩玉洁等人[21]在固定化乳酸菌发酵制备L-乳酸的初步研究中对影响固定化乳酸菌发酵玉米淀粉糖化液的主要因素进行了研究,并用响应面分析法优化了固定化发酵的培养基成分。结果表明，海藻酸钠质量分数为2%,凝胶颗粒直径在1.3～1.7mm为固定化乳酸菌的最优条件；糖化液140g/L,玉米浆76.3g/L,碳酸钙70g/L为固定化发酵的最佳培养基组成，在此条件下乳酸产量可达132.4g/L。

柯昌武等[22]采用卡拉胶包埋具有环氧琥珀酸水解酶活性的诺卡氏菌菌体用于生产酒石酸。固定化的最适卡拉胶浓度为20g/L，菌体浓度为200g/L，交联剂戊二醛浓度为5g/L，固定化后的酶活回收率可以达到70%。高浓度的环氧琥珀酸对水解反应产生抑制作用，游离细胞的米氏常数(Km)为0.234mol/L，抑制常数(KI)为0.22mol/L，固定化细胞则分别为0.31mol/L和0.21mol/L。游离细胞和固定化细胞反应的最适pH分别为8.0和8.5。细胞固定化以后，耐热稳定性增强。30℃0.2mol/L的底物浓度下，摇瓶中连续转化25批,L( )酒石酸的转化率接近100%。

胡永红等[23]对产氨短杆菌MA-2固定化细胞在富马酸铵体系中转化生成L-苹果酸的优化工艺条件做了探讨，结果表明，富马酸铵浓度为1.8mol/L，pH7.0-8.0，反应温度为37℃，L-苹果酸得率达200g/L左右。同时，对固定化细胞的动力学进行了研究，结果为：rmax＝58mmol/（Lhg（固定化湿细胞）），Km＝6.2510＾(-2)mol/L，pm=1.56mol/L。

冯小海等人[24]构建了一种纤维床反应器（FBB），并将其应用于丙酸的生产。将棉纤维绕成桶状，固定于反应器中，即可用于丙酸固定化发酵。以40g/L的葡萄糖为碳源，与游离细胞相比，利用FBB生产丙酸，丙酸产量由14.58g/L提高至20.41g/L，发酵时间由120h缩短至60h。研究了不同糖浓度条件下FBB生产丙酸情况，并将补料策略应用于丙酸发酵中。结果表明：补料发酵能够有效改善PropionibacteriumfreudenreichiiCCTCCM207015在高糖条件下丙酸对葡萄糖转化率较低、副产物较多的问题。经补料发酵280h，丙酸产量迭45.91g/L，丙酸质量约占有机酸总质量比例为72.31％。

1.6对D-乳酸固定化发酵载体研究的目的和意义

以本室高光学纯D-乳酸生产菌YBS1-5为实验对象，通过监测固定化发酵过程中菌体浓度、残糖量和D-乳酸含量变化，在以7L发酵罐为主控单元构建的外循环式固定装置条件下，考察不同固定化载体对D-乳酸发酵生产速率、产品光学纯度及装置运行稳定性的影响，优选适宜的固定化载体，为后续固定化发酵工艺的进一步优化及工艺放大奠定基础。

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2. 研究的基本内容、问题解决措施及方案

1）通过文献检索固定化发酵有机酸相关文献，在详细阅读理解的基础上制定实验方案。

2）构建以7l发酵罐为主控单元的外循环式固定装置；

3）通过测定发酵液中的菌体浓度、残糖量和d-乳酸含量，考察不同固定化载体（碳纤维、棉纤维、甘蔗渣、无纺布）条件下d-乳酸发酵过程；