灵芝三萜酸提取工艺研究（二）开题报告

1. 研究目的与意义、国内外研究现状（文献综述）

灵芝为担子菌纲多孔菌科灵芝属真菌，其学名现已订正为ganoderma lingzhi^[1-2]，是我国名贵的药用真菌之一。灵芝属共有80多种灵芝，《中国药典》(2000年版)规定赤芝g.licuidum和紫芝g.japonica为药用正品。灵芝含有多种化学成分，包括多糖类、三萜类、街醇类、生物碱类、吠喃衍生物、氨基多肽类、无机元素、脂肪酸等，其中苦味三萜类化合物为灵芝主要有效成分，由于它具有广泛的药理活性而受到普遍的关注。药理研究证明灵芝三萜具有抗肿瘤、抗hiv、抗炎、保肝护肝等多种药理活性^[3]。如灵芝酸(garnoderic acid)a、b、c和d能抑制小鼠肌肉细胞组胺的释放，灵芝酸f(garnoderic acid f)有很强的抑制血管紧张素酶的活性，赤芝孢子酸a(ganosporeric acid a)则对ccl₄和半乳糖胺及丙酸杆菌造成的小鼠转氨酶升高有降低作用^[4-6]。现代研究揭示，灵芝具有补气安神、止咳平喘的功效，用于眩晕不眠、心悸气短、虚劳咳喘。临床上可以治疗神经衰弱、慢性支气管炎、心脑血管等疾病；配合抗生素可以治疗细菌性疾病，降低抗生素的毒副作用；配合治疗肿瘤，可降低放疗、化疗引起的副反应；常服灵芝可提高人体抗病能力，显著增强免疫功能^[7]。

灵芝三萜酸是灵芝三萜类化合物中一类重要的活性成分，具有显著的药理作用和保健价值。因而，对灵芝三萜酸的提取工艺展开研究，具有十分重要的意义。灵芝三萜极性较小，不溶于水，溶于氯仿、丙酮等有机溶剂。灵芝三萜的传统提取方式有浸渍法。浸渍法常用于一些热不稳定性的中药成分的提取，其特点是提取时不需要加热，使用的溶剂种类多，提取范围广。该提取方法，三萜较为稳定，提取率重复性好。张宪民等^[8]在室温条件下用氯仿或丙酮来提取灵芝中的灵芝三萜化合物，同时考察了不同提取溶剂，方法对提取效果的影响。但受灵芝三萜的结构影响，溶剂浸提法花费时间长且得率较低，而超声辅助提取技术作为一种新技术，能破坏灵芝的致密结构，提高三萜类物质得率，缩短提取时间^[9]。除此之外，超临界二氧化碳萃取方法^[10]提取灵芝三萜物质，该方法安全、无毒，不会被提取物反应改变活性，被称为绿色生物分离技术，是当今世界上能够用于规模生产的最先进的分离萃取技术。但在已有文献的记录中，采用曲面响应法进行灵芝三萜酸提取工艺的优化鲜有报道。响应曲面法是利用合理的试验设计并通过对实验数据进行一定的处理，建立影响因素与响应值之间的函数关系，得到一个回归方程，通过对回归方程进行分析，选择最优工艺参数。

如何评价灵芝三萜酸提取工艺的优劣，就需要对灵芝三萜酸进行含量检测。目前对于灵芝中的三萜类物质测定的方法有很多，其中紫外分光光度法是一种快速检测和定量测定灵芝中三萜类化合物总含量的方法。除此之外，对于中药三萜类单体成分的分析，测定方法有光谱学、生物学及色谱学方法等，尤以色谱法应用最广泛。色谱法包括薄层色谱法、气相色谱法、高效液相法，以及它们与质谱联用技术等。其中薄层色谱法经济、简单、分离能力强，相当一部分三萜类化合物可以通过这种方法进行定量，但其重现性、选择性较差，直到高效薄层色谱法的出现才得以改善。气相色谱法在三萜类化合物的分析中占有一定比例^[11-12]。由于该方法要求化合物具有一定的挥发性，许多挥发性较弱的三萜类化合物需要进行衍生化处理，因而在一定程度上限制了方法的应用。目前，高效液相色谱法(hplc)是三萜类化合物分析的最常见方法。另外，随着液质联用(lc-ms)技术的日趋成熟，其在三萜类化合物的定量研究中日益引起重视。

2. 研究的基本内容和问题

研究目标：

以灵芝中灵芝酸a（garnoderic acid a）和灵芝酸c₂（garnoderic acid c₂）的hplc法检测作为指标，利用响应曲面法优化灵芝三萜酸提取的最佳提取工艺。

研究内容：

3. 研究的方法与方案

研究方法及实验方案：

1、用提取样品进行HPLC检测预实验，确定梯度洗脱条件及检测条件

a) 通过查阅文献，利用别人的梯度洗脱条件及检测条件进行检测；

b) 根据实际的谱图出峰情况进行梯度洗脱条件及检测条件的调整。

2、利用灵芝三萜酸标准品及样品进行方法学考察

a) 线性关系考察，用梯度浓度的灵芝酸A（garnoderic acid A）、灵芝酸C₂（garnoderic acid C₂）标准品进行检测，获得标准曲线；

b) 精密度考察，对提取样品连续进样5次，以检测结果的RSD考察仪器的精密度；

c) 稳定性考察，对提取样品在0h、4h、8h、12h、24h进样，以检测结果的RSD反应样品的稳定性；

d) 重复性考察，在确定的提取工艺条件下制备5份提取样品，对每份提取样品进样检测，以检测结果的RSD考察样品重复性；

e) 回收率考察，取已知含量的提取样品5份，分别加入已知量的标准品，HPLC测定，以检测结果计算回收率。

3、单因素实验探究灵芝三萜酸提取的工艺条件

a) 提取时间的确定，准确称取灵芝超细粉2g，在80%乙醇、磁力搅拌器可测外温90 ℃的条件下按1 h、2 h、3 h、4 h、5 h进行提取，进行HPLC测定；

b) 乙醇浓度的确定，准确称取灵芝超细粉2g，按乙醇浓度60%、70%、80%、90%、100%的不同条件，磁力搅拌器可测外温90 ℃下进行提取，进行HPLC测定；

c) 提取温度的确定，准确称取灵芝超细粉2 g，在80%乙醇、磁力搅拌器可测外温65 ℃、75 ℃、80 ℃、85 ℃、95 ℃下进行提取，进行HPLC测定。

4、根据检测结果，以提取时间、提取温度、乙醇浓度为主要考察因子，采用Box-behnken模型进行多因素考察的响应曲面设计实验

5、数据处理，利用Design Expert 8.0软件进行数据处理，获得灵芝三萜酸的最佳提取工艺

技术路线：

可行性分析：

本实验所用的研究方法，包括提取时采用的响应曲面法以及检测时采用的HPLC法已发展成熟，各实验步骤均有可靠的理论依据。响应曲面法对于灵芝三萜酸的提取是比较新颖的。本人已掌握了一定的仪器分析知识，能够熟练地使用实验中所需的高效液相色谱仪。依据相关文献中的实验方案，本实验对HPLC法进行方法学考察，确定最佳色谱条件，这样在检测灵芝中三萜酸这种微量物质时具备了可行性。

4. 研究创新点

响应曲面法作为提取灵芝三萜酸的方法在文献中较少报道，本实验采用曲面响应法提取灵芝三萜酸，以探索灵芝三萜酸的最佳提取工艺。对灵芝三萜酸进行HPLC检测，以此作为响应曲面法提取灵芝三萜酸的数据依据，这是本实验的特色之处。

5. 研究计划与进展

分三个阶段：

1．从2015年12月到2016年1月

a) 查阅相关文献；