鬼臼类中药材DNA条形码鉴定研究开题报告

1. 研究目的与意义（文献综述）

1.1课题研究的目的、意义；

鬼臼类中药材药用历史悠久，始载于《神农本草经》，列为下品，根据记载“鬼臼味辛温，主杀蛊毒、鬼疰、精物；辟恶气不祥，逐邪，解百毒。”临床用于治疗毒蛇咬伤、痈疖肿毒、跌打损伤、风湿疼痛等症。以干燥根茎及根入药，主要来源于小檗科(berberidaceae)鬼臼属(dysosmawoodson)、桃儿七属(sinopodophyllumying)、山荷叶属(diphylleiamichx)及足叶草属(podophylluml)这4个属12种药用植物。除足叶草(鬼臼)属外，分布在我国的有3个属，即山荷叶属、八角莲属和桃儿七属，共10个种，其中鬼臼属为我国多型特有属，该属7个种为我国特有的国家级保护植物，且八角莲与六角莲被列为国家Ⅲ类保护品种，神农架著名珍稀中药材“四个一”之一“江边一碗水”的3种药材来源：南方山荷叶、八角莲、六角莲也均为鬼臼类中药材品种。因该类药材的基原植物对生长环境要求苛刻、生长缓慢，加之人们的任意采挖，使得野生资源急剧骤减、药材资源异常短缺、临床应用受到严重限制，资源保护工作亟待加强。因此，运用生物学手段，对其dna条形码分子鉴定，为解决其供需矛盾、满足人工栽培的需要、解决鬼臼类中药材野生药用植物资源缺乏等问题奠定基础。

鬼臼类中药材因其活性成分复杂多样并具有广泛的药理作用和临床应用价值，受到国内外科研工作者的普遍关注。鬼臼类中药材共有的活性成分主要有鬼臼毒素、鬼臼毒酮、山荷叶素、山奈酚、槲皮素等。其药理作用主要有抗病毒、抗肿瘤、对平滑肌的抑制作用、促进胃肠道蠕动增快、对中枢神经系统的抑制作用、增强免疫力，以及抗菌抗氧化作用，另外在农业方面，还具有杀虫、抑制植物生长等作用。与此同时，也因鬼臼毒素对胃肠道的刺激作用以及中枢神经系统的抑制作用使得其临床应用受到一定限制，其半数致死量约为33~40mg。但由于鬼臼类中药材“江边一碗水”药材来源说法不一，科学界目前仍无定论，该药材及其基原物种的别名繁多，极易混淆。且经过前期的市场调研，发现四大药材市场及一些其他药商药店亦常将八角莲、六角莲、南方山荷叶弄混，造成市场混乱，药材质量良莠不齐，而不同品种的鬼臼类中药材所含鬼臼毒素含量有差异，混用或误用，若达到中毒剂量，势必导致副作用和用药安全隐患。因此强品种来源及其质量鉴定，对于拟定该类药材的质量标准、促进临床用药安全有效、减少稀缺性中药资源浪费等，均具有十分重要的意义。

2. 研究的基本内容与方案

2.1研究内容

鬼臼类中药材DNA条形码分子鉴定：5个物种的基原植物样本及药材样本的收集及专家鉴定，应用不同方法进行实验样本DNA的提取，探索改良后分别针对鬼臼类中药材原植物及药材的DNA提取最佳方案，从ITS2、ITS、psbA-trnH、matK、rbcL等引物中筛选出扩增效率最高并能将鬼臼类植物均较好地区分开来的引物序列，建立鬼臼类中药材DNA条形码鉴定体系。

2.2研究目标

①采用DNA条形码技术对鬼臼类3个属5个品种的基原植物和药材进行分子水平上的鉴定，找出适合鬼臼类原植物叶片和根茎类药材的DNA提取方法，对DNA条形码候选序列进行barcodinggap检验及构建DNA条形码鉴定体系。

②建立一种“快速、准确、方便”的鉴定鬼臼类中药材的分子生物学鉴定方法，实现鬼臼类中药材快速准确鉴定，规范其市场，加强品种来源鉴定，保障其合理安全用药。

2.3拟采取的技术方案及措施

2.3.1DNA条形码分子鉴定部分

研究方法：

①实验材料的收集与鉴定

原植物实验样本的采集覆盖湖北神农架、恩施，四川，浙江，云南，贵州，西藏，陕西等地，每个品种需覆盖2个以上主产地，3份以上原植物样本；每个品种的药材样本需来自3个不同主产区，3份以上药材样本；所有的原植物和药材均经过实验室老师的检验。

②DNA提取方法的选取

采用天根生化科技（北京）有限公司的植物基因组DNA试剂盒(TianagenBiocethCo，China)提取总DNA，在此方法及基础上，结合传统CTAB法，改良并逐步优化提取方案，使提取效率达到最高。

③PCR扩增引物的筛选和体系配置

设计并合成以上各组DNA条形码通用引物，选择部分实验样本，分别运用不同引物片段配置不同PCR体系，并在不同的PCR扩增程序下对实验样本分别进行扩增，得到不同组的PCR产物。

国际通用的DNA条形码引物序列有以下几种：

表1几种常用的国际通用引物序列

PCR反应体系的配置：

表2反应体系（25uL）的配置

几种通用引物的PCR扩增程序设置：

表3PCR扩增程序

④琼脂糖凝胶电泳检测

制备1%的琼脂糖凝胶，加入核酸染料，插入梳子，待其冷却凝固后，将4uLPCR产物分别加入点样孔，插上正负极连接线并启动电泳仪，使DNA自负极向正极移动，电泳电压为120V左右，电泳15-20min，完成后切断电源。将胶块取出置于302nm波长的紫外灯下查看结果，选取条带明亮，且清晰单一的PCR产物送测序公司测序，没有检测出条带的要分析原因，并改善实验方案，再进行以上操作。

⑤PCR产物测序及数据处理与分析

获得测序公司返回的峰图，采用CodonCodeAlignerV4.1（CodonCode，Dedham，MA，USA）对测序峰图进行校对拼接，去除引物区。将获得的各组序列用软件MEGA5.0（molecularevolutionarygeneticsanalysis）进行序列分析比对，并基于K2P模型进行遗传距离等分析，用邻接（NJ）法构建系统聚类树，利用bootstrap（1000次重复）检验各分支的支持率。确定扩增效率最高且鉴定效果最佳的引物序列，建立鬼臼类中药材DNA条形码鉴定体系。

3. 研究计划与安排

1-2周：查阅相关文献资料，明确研究内容，了解研究所需的实验仪器和药品试剂。确定方案，完成开题报告。

第3-12周：完成实验样本的搜集工作，结束全部样品的dna提取、pcr扩增、测序。

筛选最佳dna条形码序列或组合序列，使鉴定效率达到100%或接近100%，完成dna分子鉴定的研究成果报告；

4. 参考文献（12篇以上）

1.chens,xuj,liuc,etal.genomesequenceofthemodelmedicinalmushroomganodermalucidum.[j].naturecommunications,2012,3(2):177-180.

2.pangx,liuc,shil,etal.utilityofthetrnh–psbaintergenicspacerregionanditscombinationsasplantdnabarcodes:ameta-analysis[j].plosone,2012,7(11):e48833.

3.qianj,xuh,songj,etal.genome-wideanalysisofsimplesequencerepeatsinthemodelmedicinalmushroomganodermalucidum[j].gene,2012,512(2):331–336.