1. 研究目的与意义（文献综述包含参考文献）
1 γ-PGA的特性概述及应用
1.1 γ-PGA的概述
聚谷氨酸(γ-polyglutamic acid,γ-PGA)，是由L-谷氨酸和D-谷氨酸单体之间通过α-氨基和γ-羧基形成肽键之后生成的同聚酰胺，分子质量一般在100-1000 KD [1]，具有增稠、乳化、保湿和粘接等功能特性，高分子生物制品具有很强的开发价值和前景[2-4]。
不同微生物合成的γ-PGA分子立体结构和分子量不完全相同。目前已经发现的γ-PGA的结构有三种：D-谷氨酸组成的聚合物（γ-D-聚谷氨酸），L-谷氨酸组成的聚合物（γ-L-聚谷氨酸），D-谷氨酸和L-谷氨酸共同组成的聚合物[5]（γ-DL-聚谷氨酸）。结构式如图1.1。
1.2 γ-PGA的性质
1. 吸水特性
γ-PGA 易溶于水，具有很好的吸水特性。王传海等人[6]通过研究发现相对于目前市场上的聚丙烯酸盐类吸水树脂，γ-PGA的最大自然吸水倍数高其1倍。γ-PGA溶于土壤中有一定的保水力和相当理想的缓释效果，有抗旱促苗效应[6]。
2. 生物可降解性
γ-PGA 具有无公害、生物可降解性和容易被机体吸收等优点，它可以充当营养源被 γ-PGA 生产菌株利用。因此，发酵生产 γ-PGA 的培养时间对产量有较大的影响，时间过长会导致 γ-PGA 分子被微生物酶解利用而损失。
3. γ-PGA的水解特性
低分子量的γ-PGA和谷氨酸单体可以通过γ-PGA在一定的条件下水解得到。黄金等人[6]发现水溶液中的γ-PGA加热可使多肽链随机断裂。吕莹等人[7]通过研究也发现通过17 h 就可使γ-PGA完全水解为谷氨酸，这个发现可以测定γ-PGA纯度。
1.3 γ-PGA的合成方法
1. 化学合成法
高分子的键合方式和空间化学结构可以通过化学合成方法[7]任意设计，它可以分为肽合成法和二聚体缩聚法[8]。前者是通过氨基酸逐个连接形成多肽。后者由L-Glu，D-Glu及消旋体( DL-Glu )经过一系列的化学修饰最终制得γ-PGA。
2. 提取法
早期日本生产的γ-PGA 主要是用乙醇从纳豆中提取的。提取过程中由于纳豆中含有的γ-PGA 的量很少，且不稳定，所以副产物量大，工艺也比较复杂，导致提取成本提高，最终难以大规模生产，亦不能做为主要方法生产γ-PGA。
3. 微生物合成法
相比较于化学合成法和提取法，微生物合成法的工艺简单并且γ-PGA产量高，适用于大规模工业化生产，也成为许多学者研究的对象。但迄今为止，γ-PGA发酵生产仍在实验室阶段，这些生产方法主要有液体发酵法、固定化酶法、分批发酵法、连续发酵法、搅拌罐反应器自循环发酵法等几种，由于分批发酵法操作简单，容易控制，在实验室研究中应用较为广泛。微生物合成法代谢图见图1.2。
1.4 γ-PGA的应用
γ-PGA 具有独特的理化和生物学特性。在环境领域中作为可降解材料的替代物，γ-PGA也可作为保湿剂、增稠剂、防冻剂、高分子纤维、医用生物粘合剂、生物絮凝剂和重金属吸附剂等，可广泛用于化妆品、食品加工与保鲜、农业防冻、包装材料、医药和环境处理等领域，具有极高的开发价值和广阔的应用前景[9]。表1.1讲述了γ-PGA在各个领域的应用。
表1.1 γ-PGA的应用
应用领域 | 产品 | 公司 |
医药 | 聚谷氨酸紫杉醇 | Cell Therapeutics公司 |
食品 | 食品保水剂疏松剂 | 南京赛泰斯生物科技有限公司 |
化妆品 | 优质丝胎粉 | 湖州新天丝生物技术有限公司 |
农业 | 植物生长促进剂 | 昆山市博尔日化工有限公司 |
2 Surfactin
2.1 Surfactin的概述与结构
生物表面活性剂（biosurfactants）主要包括糖脂、脂肽、脂蛋白、磷脂等，被广泛地称为抗菌剂和抗粘附剂[10]。其中表面活性剂（surfactin）是脂肽表面活性剂中应用广泛的一种。由于生物表面活性剂的特性，使其有很广泛的应用，如在乳液聚合中起乳化作用，食品生产中起起泡作用，以及溶解农药、润滑、抗静电以及杀菌等作用[11]。
含氨基酸类生物表面活性剂顾名思义是以氨基酸链或环为亲水基团的生物表面活性剂。这类物质中具有代表性的有脂肽、脂蛋白和脂氨基酸等。脂肽由亲水的肽链和亲油的脂肪链两部分组成[12],其中较为典型的脂肽如Surfactin的结构见图1.3。
2.2 Surfactin的性质
1. 化学性质
脂肽由于其特殊的两亲结构以及复杂的分子空间结构，具有显著的表/界面活性。当溶液中，脂肽分子的两亲性还表现为当浓度超过一定的数值，通过碳氢链的疏水作用，脂肽分了定向吸附在溶液内部形成胶束，而该浓度即为临界胶束浓度(CMC) [13]。
2. 生物活性
Kim等发现[14]，带有环状结构的Surfactin能够抑制细胞生存调节信号的传递，由于这种针对性的干扰导致肿瘤细胞调亡。He等[15]通过分离得到的circulocins环脂肽，可用于治疗由革兰氏阳性菌干扰所并发的细菌感染，据研究，Surfactin对逆转录酶病毒、疱疫病毒、传染性法氏囊病毒或者DNA病毒等具有直接灭活作用，对猪细小病毒等具有明显的抑制作用，其中对口蹄疫病毒效果最为明显[16,17]。Tadashi等[18]研究结果显示，表面活性素Surfactin可诱使凝血系统中纤维溶解酶活化，对纤维蛋白的单体及聚合物均有影响，抑制血块的形成。
3. 物理性质
产物Surfactin还具有很强的热稳定性，在100 C 的高温下2h，表面活性几乎保持不变；pH适应范围广，在pH5.0-8.0内，表面活性不受影响；对高浓度盐耐受性好，添加混合50g/LNaCl的0-120g/L CaCl2 溶液，表面活性受影响很小。
2.3 Surfactin的应用
生物表面活性剂具有卓越的表面活性和界面活性,是一种理想的乳化剂、悬浮剂、增稠剂、起泡剂和消泡剂，可用于石油工业、日化品工业和食品工业等方面。生物表面活性剂还能帮助降解有机物和移除重金属，对环境的改善有着不可替代的作用。生物表面活性剂除了上述性能特点之外，其亲和力强，对生物刺激性小，对环境污染小。
3 生防芽孢杆菌的特性概述及应用
3.1 枯草芽孢杆菌的生物学特性
枯草芽孢杆菌如图1.4[19]为革兰氏阳性好氧细菌；细胞形态杆状；大小一般为0.7-0.8 nm * 2.0-3.0 μm；运动；周生鞭毛不但长而且很丰富；芽孢中生或偏中生且呈椭圆形，即使孢囊膨大也不显著；生长最低温度5-20 ℃，最高温度45-55 ℃[20]。
3.2 枯草芽孢杆菌的生防作用机制
关于枯草芽孢杆菌的生防作用机制，许多学者做了广泛而深入的探讨，概括起来有竞争作用、拮抗作用、诱导植物抗病性等几方面[21,22,23]。
竞争作用是微生物重要的生防作用机制。枯草芽孢杆菌主要通过营养竞争和空间位点竞争的方式发挥竞争作用，其中以空间位点竞争最为常见。
拮抗作用是指至少两种及其以上种类的微生物共同生长时，其中某种微生物在代谢过程中产生的一些物质，如抗菌素等，这些物质改变了他们共同生长的微生态环境，导致另一种或几种微生物的生长受到抑制或死亡的生物现象。
诱导植物产生抗病性是指枯草芽孢杆菌除了直接抑制和杀死病原微生物之外，还可以诱发植物自身的抗病潜能。有研究表明，有些枯草芽孢杆菌可以产生某些信号蛋白，有些枯草芽孢杆菌可以直接分泌相关蛋白诱导植物抗病性[21]。
3.3 枯草芽孢杆菌的生防应用现象
枯草芽孢杆菌是自然界普遍存在的植物内生细菌，对生态环境安全友好。因其培养条件简单，繁殖速度快；能产生多种抗菌物质，抗菌谱广；可产生内生芽孢，抗逆性强，适应性广等特点，具有很好的生防开发潜力，己被成功用于多种病害的生物防治[21]。
4 研究内容
4.1 接种
在已经紫外杀菌20-30分钟的超净台里将平板上枯草芽孢杆菌723用接种环接入LB培养基中，放入37℃，200rpm的摇床上振荡培养10-12h。
4.2 发酵
取出LB培养基于紫外杀过菌的超净台上转接，转接之后放入摇床上振荡培养，条件是37℃，200rpm，培养36h。
4.3 样品分析
从摇床上取出发酵培养基，对其进行数据分析。
1. pH的测定
定位精密pH计，测量摇瓶内菌体的pH，记录数据，3个平行，如果有相差甚大的弃去，分别取样去测液相。
2. 粘度的测定
平衡数显粘度计，打开仪器，选取适宜的转子安装，取适量的菌体保证转子没入菌体并且不碰壁，在60rpm和100rpm下分别测定其粘度。记录数据。
3. 聚谷氨酸的提取
取菌体50ml于锥形瓶中加入两倍体积的无水乙醇，振荡，使之凝聚在一起，用镊子取出放入标记好的平板上，放入烘箱烘干，取出称重，并记录数据。
4. Surfactin的测量
样品的预处理：第一步，取6ml发酵液于10ml离心管，12000rpm，离心15分钟。第二步，取300μL上清于2ml离心管，再加1.2ml色谱级的无水乙醇，充分振荡离心。第三步，取上清过膜（有机膜）。
流动相的处理：本实验使用的流动相为0.05%三氟乙酸和甲醇。使用水膜抽滤0.05%三氟乙酸，有机膜抽滤甲醇。
色谱分析：Summit高效液相色谱仪（ 美国戴安公司 ），由 P680 HPLC 泵、UVD-170 可变紫外检测器、TCC 2100柱温箱、8125型进样装置组成；工作站（美国戴安 Chromeleon 系统）戴安U3000液相色谱仪，色谱柱，Venusil MPC18（ 4.6*250 mm，5 μm ）；流动相，0.05 % 三氟乙酸：甲醇=10:90；流速0.8 ml/min；检测波长214 nm；进样量40 μl ；柱温35 ℃。在相同色谱条件下，利用液相内标定量法利用峰面积比可计算出发酵液中各组分的含量。
5目的和意义
生物表面活性剂Surfactin具有抑制部分土传病害的能力，聚谷氨酸具有缓释和刺激植物生长发育的能力。本实验室已筛选出一种同时产聚谷氨酸和Surfactin，并具有良好生防功能芽孢杆菌菌株。本研究旨在对该菌株的发酵工艺进行优化，获得高产发酵技术。
参考文献
[1] 吕莹，郝紫微，李虹，等.聚γ-谷氨酸的分离提纯 [J].食品与发酵工业 , 2005,31(2): 133~134.
[2] Jin Hwan D H, Nam Chang, Sang Yup Lee Efficient recovery of γ-poly(glutamic acid)from hight viscous culture broth [J]. Biotechnol Bioeng , 2001,11 (76):219~223.
[3] Auzenne E, Donato N J, Li C, et al. Superior therapeutic profile of poly-L-glutamic acid-paclitaxel copoly mer compared with taxol in xenogeneic compart mental model of human ovarian carcinoma [J].Clin Cancer Res , 2002,8(2):573~581.
[4] 施庆珊.γ-聚谷氨酸的微生物合成与应用 [J].精细与专用化学品 ，2004,12(11): 20~23.
[5] Ashiuchi M, Nakamura H, Yamamoto T ,et al. Poly-γ-glutamate depolymerase of Bacillus subtilis: production, simple purification and substrate selectivity [J]. J Mol Catal B: Enzym , 2003, 23 (36): 249~255
[6] 王传海，何都良，郑有飞等．保水剂新材料γ-聚谷氨酸的吸水性能和生物学效应的初步研究 [J]．中国农业气象 ，2004,25(2) :19~22.
[7] 程艳玲，赵玉娥，王海玉．生物降解型聚谷氨酸的研究进展 [J]．北京联合大学学报(自然科学版) ，2008,6: 46~49.
[8] Sanda F, Fujiyama T, Endo T. Chemical synthesis of polygamma glutamic acid by poly condensation of gamma glutamic acid dimmer: synthesis and reaction of poly gamma glutamic acid methyester [J]. PolymScience Part A1 , 2001, 39(5): 732~ 741.
[9] 姚凯，王庭慰．谷氨酸类聚合物的合成方法及其应用 [J]．现代塑料加工应用 ， 2005，17(5)：62~64.
[10] VelraedsM,vanderHC,ReidG,etal.Physicochemicalandbiochemical
characterizationof biosurfactantsreleasedbyLactobacillusstrains [J].ColloidsandSurfacesB:Biointerfaces ,1996,8(1):51~61.
[11] LinSC.Biosurfactants:recentadvances [J].JournalofChemicalTechnologyandBiotechnology, 1996,66(2):109~120.
[12] 刘向阳，杨世忠，牟伯中.微生物脂肽的结构. [J].生物技术通报 ，2005,4(1):18~27.
[13] Li Y, Ye R Q , Mu B Z. Influence of sodium ions on micelles of surfactin-Ci6 in solution [J]. Surfact Deterg . 2009, 1(26): 31~36.
[14] Kim S Y, Kim J Y, Kim S H, et al. Surfactin from Bacillus subtilis displays anti-proliferative effect via apoptosis induction, cell cycle arrest and survival signaling suppression [J]. FEBS Lett . 2007, 581(51): 865~871.
[15] He H, Shen B, Korshalla J, et al. Circulocins, new antibacterial lipopeptides from Bacillus circularize [J]. Tetrahedron. 2001, 57(14): 1189~1195.
[16] Kracht M, Rokos H, Ozel M, et al. Antiviral and hemolytic activities of surfactin isoforms and their methyl ester derivatives [J]. Antibiot (Tokyo). 1999, 52(21): 613~619.
[17] Vollenbroich D, Ozel M, Vater J, et al. Mechanism of inactivation of enveloped virusesby the biosurfactant surfactin from Bacillus subtilis [J]. Biologicals. 1997,25: 289~297.
[18] Tadashi K , Keiji H. Enhancement of plasminogen activation by surfactin C:augmentation of fibrinolysis in vitro and in vivo [J]. Biochim Biophys Acta. 2002, 96(9): 234~245.
[19] 张丽霞.枯草芽孢杆菌B908发酵工艺优化研究. [J].中国生物防治，2006，21 (5): 18~31.
[20] 梁文平，郑斐能，王仪，等.21世纪农药发展的趋势:绿色农药与绿色农药制剂. [J].农药，1999,38(9): 1~2.
[21] 张承胤，邢彦峰，代丽，等.适应玉米秸秆还田的小麦根病拮抗细菌的筛选. [J].中国农学通报，2009,25(3): 206~209.
[22] R.E.戈登，W.C.海恩斯，C.HN.帕格.芽孢杆菌属. [M].北京:农业出版社,1983:45(9):11~32.
[23] 赵达，傅俊范，裘季燕，等.枯草芽孢杆菌在植病生防中的作用机制与应用. [J].辽宁农业科学,2007(1): 46~48.
2. 研究的基本内容、问题解决措施及方案
1 本课题要研究或解决的问题
本研究旨在对该菌株的发酵工艺进行优化，获得高产发酵技术。
2 拟采用的研究手段
