分子伴侣对极耐热α-L-鼠李糖苷酶可溶性表达的影响开题报告

1. 研究目的与意义

α-l-鼠李糖苷酶[ec. 3.2.1.40]作为一类糖苷水解酶，能特异性切割多种天然糖苷化合物末端的非还原性鼠李糖基，例如淫痒藿苷，柚皮苷，橙皮苷等。

近年来，由于α-l-鼠李糖苷酶具有较大的应用前景，引起了广泛而深入的研究。

研究多采用基因重组大量获得目的α-l-鼠李糖苷酶，但外源蛋白质在e.coli中表达时，常常出现表达的蛋白质形成包涵体或被蛋白酶降解的情况，原因大多是表达的蛋白质没能进行正确的折叠[ ]，这不利于研究蛋白质功能。

2. 国内外研究现状分析

目前，对于分子伴侣促进外源蛋白质在大肠杆菌中的可溶性表达，主要通过使用分子伴侣共表达系统及优化共表达条件，减少包涵体形成，提高酶活性。

例如郭永华等，通过优化表达条件及使用分子伴侣共表达系统提高了环糊精葡萄糖基转移酶的可溶性表达和胞外酶活；s. bu, p.w.k. tsang等利用分子伴侣与目的基因载体共表达，使木酮糖激酶在大肠杆菌中的可溶性表达提高了77倍。

张亚慧等，为实现胆固醇酯酶的可溶性表达，将酶及其分子伴侣通过人工添加的sd序列在大肠杆菌中进行串联表达，成功获得可溶性表达,摇瓶水平的总酶量达1077 u/l。

3. 研究的基本内容与计划

1. 筛选几种分子伴侣质粒与PET-28a-TpRha重组质粒的共表达菌株；2. 比较PET-28a-TpRha质粒单独表达及其与几种分子伴侣共表达菌株中可溶性目的蛋白表达情况；3. 对提高目的蛋白可溶性表达的分子伴侣共表达菌株进行表达条件优化；4. 目的蛋白的纯化及其在淫羊藿黄酮转化上的应用。

研究计划：1. 查找与翻阅相关文献，了解整个课题的方向2018.1-2018.22. 筛选能提高目的蛋白可溶性的分子伴侣，并对筛选得的分子伴侣与目的蛋白共表达菌株进行表达条件优化2018.2-2018.53. 目的蛋白的纯化及其在淫羊藿黄酮转化上的应用2018.4-2018.54. 补充实验，撰写论文及论文答辩2018.5-2018.6

4. 研究创新点

通过构建目的基因与6种分子伴侣的共表达系统(pKJE8、pKJE7、pGro7、pKJE6、Pt-f16 和 pG-Tf2)，筛选可提高目的蛋白可溶性表达并具有较高酶活的分子伴侣，优化其与目的蛋白的共表达条件,提高a-L-鼠李糖苷可溶性表达和胞外酶活，为嗜热菌来源α-L-鼠李糖苷酶的高效表达及提高重组酶的可溶性表达提供了研究基础。