对极耐热α-L-鼠李糖苷酶异源表达的研究开题报告

1. 研究目的与意义

α-L-鼠李糖苷酶是一种能够催化水解许多天然产物末端鼠李糖的糖苷水解酶，该酶在自然中广泛存在，已有研究报道该酶在细菌，真菌，植物，哺乳动物组织中均有发现。对于嗜热菌来源的α-L-鼠李糖苷酶有较高的最适反应温度及稳定性，在工业上有很大的应用价值，但嗜热菌来源酶中二硫键含量相对较高，宿主菌的选择对嗜热菌来源α-L-鼠李糖苷酶的有效可溶性表达有很大影响。作为一种新兴的表达宿主，短小芽孢杆菌的芽孢已经被敲除，并且经研究表明不产生内毒素，且经其进行的目的蛋白表达几乎不含包涵体、重组蛋白胞外分泌量高。E.coli BL21 (DE3)是实验室常用表达菌株，能表达克隆于含有噬菌体T7启动子的表达载体（如pET系列）的基因。E.coli Origami(DE3)在thioredoxinreductase(trxB)和glutathionereductase(gor)基因上同时含有突变，这使得该菌株能够更加高效的在细胞质内生成二硫键，有助于含二硫键蛋白的活性蛋白形成。本实验构建极耐热α-L-鼠李糖苷酶的三种表达系统，并对目的蛋白在三种表达宿主中的表达情况进行比较，为嗜热菌来源α-L-鼠李糖苷酶的高效表达提供研究基础。

2. 国内外研究现状分析

α-l-鼠李糖苷酶是一种能够催化水解许多天然产物末端鼠李糖的糖苷水解酶，它在工业上常用于去除柑桔汁中柚皮苷的苦味，将橘皮苷水解为l-鼠李糖和橘皮素糖苷等。另外，α-l-鼠李糖苷酶可以作用于萜烯基糖苷，在改善葡萄汁和饮料的香气成分方面有很重要的应用，据报道，α-l-鼠李糖苷酶通过水解类黄酮糖苷、糖甙类物质增加水果中黄烷醇物质，从而改善水果的功能特性。此外α-l-鼠李糖苷酶可以提高黄酮类化合物的生物利用度。α-l-鼠李糖苷酶在医药方面也有很重要的应用，α-l-鼠李糖苷酶可以通过水解不同种类的鼠李糖苷来改善药物的特性。此外，α-l-鼠李糖苷酶还可以用于植物和细菌多糖、糖苷和糖脂的结构分析，在很多化合物的生产过程中起到重要的作用，如洋李苷、l-鼠李糖的生产等。

短小芽孢杆菌表达系统无论是在携带质粒的稳定性方面，还是在某些外源基因表达方面都具有较好的性质，甚至优于枯草芽孢杆菌。因此，它也是重要的具有商业潜力的基因工程受体菌之一。2007年，杨春晖和王海燕扩增了短小芽孢杆菌碱性蛋白酶编码基因wap q3的启动子片段，并构建了表达载体psugv4，实现了有活性的碱性蛋白酶在枯草芽孢杆菌和短小芽孢杆菌中的分泌表达。包怡红等(2008)在短小芽孢杆菌中高效地分泌表达了耐碱性木聚糖酶。刘伟丰等在国内外首次报道采用同源表达策略在短小芽孢杆菌中高效分泌表达木聚糖酶, 为该木聚糖酶产业化应用奠定了良好基础。

origamib(de3)属于大肠杆菌克隆型菌种，在thioredoxin reductase (trxb)和glutathionereductase(gor)基因上同时含有突变，这使得该菌株能够更加高效的在细胞质内生成二硫键，有助于含二硫键蛋白的活性蛋白形成。赵伟睿[13]等研究构建了表达有lactobacillusbreνiscgmcc 1306 tdc基因的工程菌(origami(de3)-pet21a-tdc)，并在此基础上，采用9种有机溶剂对该工程菌进行透性化处理，来提高其菌体表观催化活力；吴世雄等[15] 构 建基因工程菌 e. coliorigami(de3)/p et-32a( )-tre y、e. coliorigami(de3)/p et-32a( )-tre z，发现将mtsase和 mthase 分别与硫氧还蛋白（thioredoxin ,trx）进行融合表达时，融合酶 trx-mtsase和 trx-mthase 的酶活分别为 41.0 um l-1和 42.0 um l-1，分别为非融合表达时酶活力的 1.7 倍和 4.0 倍（mtsase 24.2 um l-1，mthase 10.4 um l-1）。

3. 研究的基本内容与计划

研究内容：

1. 构建短小芽孢杆菌、大肠杆菌origami (de3) 的重组表达质粒；

2. 短小芽孢杆菌及大肠杆菌origami (de3) / bl21(de3) 感受态的制备及重组质粒转化；

3. 细菌来源宿主菌中目的α-l-鼠李糖苷酶表达情况的比较；

4. 研究创新点

构建了重组α-L-鼠李糖苷酶的短小芽孢杆菌、E.coli Origami (DE3) / BL21(DE3)重组表达系统；比较了三种细菌来源表达宿主对重组α-L-鼠李糖苷酶的表达情况，为嗜热菌来源α-L-鼠李糖苷酶的高效表达及利用短小芽孢杆菌、大肠杆菌Origami (DE3) 表达宿主表达重组酶提供了研究基础。