1. 研究目的与意义
1、本课题的意义
大豆为我国重要的油料作物，在农业经济中占有重要地位。病虫害是限制大豆产量的重要不利因子，在我国大豆生产区，已报道的大豆病害有40余种，对于目前大豆生产上发生的主要病害，已有一些防治方法和措施，培育抗性品种仍是最有效途径。大豆细菌性斑疹病作为世界性病害，发病范围广，危害程度大，使大豆产量严重减产，而目前为止对其研究还不够深入。在我国的江淮地区和东北地区两大大豆主产区都有严重发病情况。但对大豆细菌性斑疹病的抗性遗传还没有系统性的相关报道。
随着大豆分子育种和基因组学研究的深入，定位抗性基因/qtl，通过标记辅助育种手段可提高育种效率。本研究拟利用南京农业大学植保学院植病系植物病原细菌实验室保存的细菌性斑疹病菌对国内外大豆种质群体进行接种鉴定，筛选出可以利用的抗病材料，并进行后续的基因分析，为今后的抗病性遗传育种打基础。
2. 研究内容和预期目标
1、研究目标
通过田间接种试验，鉴定抗病品种，为选育抗病育种提供可靠的亲本。
（1）从国内外资源中筛选出抗大豆细菌性斑疹病优异抗源。
3. 研究的方法与步骤
1、研究方法
接种试验将于2015年夏在南京农业大学江浦农学站大棚网室进行，裂区设计，主区设接C5菌株和清水对照两个处理。穴播，每穴5~8苗，两次重复。在大豆第3片复叶展开期进行大田接种，间隔10天后再接种一次，采用高压喷雾方法在叶正背两面喷雾接种。
2、技术路线
对搜集的国内外大豆材料进行抗C5菌株资源鉴定，根据抗感表型数据筛选抗病材料，并进行关联分析；利用重组自交(RILs)群体的抗C5菌株表型数据进行连锁分析；结合关联分析和连锁分析寻找新抗病QTL位点。
3、实验方案
（1）供试菌株
大豆细菌性斑疹病菌株C5,由南京农业大学植保学院植病系植物病原细菌实验室提供。将菌株在NA平板上培养24 ～48h,取单菌落在KB培养基在28℃，220rpm摇床摇菌24h后用灭菌蒸馏水配成浓度为3108CFU/mL的细菌悬浮液，用于田间试验接种。
（2）抗病性鉴定与评价方法
接种后第20天和第30天分别调查两个重复的发病情况，以病斑多少、病斑在叶片上所占的面积以及病斑是否扩展判断病情的严重程度。
参照同类病害的抗病性分级标准，结合试验所取得的各材料的感病度差异, 把感病度记载为 1、3、5、7级 （表1）。
表 1 大豆细菌性斑疹病抗性鉴定分级标准
级别 | 分级标准 | 抗病反应 |
1 | 叶片无病斑或仅散生少量局限型褐色斑点，直径0.5mm左右，病斑占叶面积1%以下 | 高抗（HR） |
3 | 病斑散生，较多局限型斑点或不规则型直径1～2mm，占叶面积5%～10% | 抗病（R） |
5 | 病斑不规则，扩展相连呈小片坏死斑，占叶面积10%～25% | 感病（S） |
7 | 病斑扩展，大块连片，占叶面积26%以上，叶片枯萎死亡 | 高感（HS） |
（3）统计分析方法
采用QTL分析软件Windows QTL Cartographer2.5及复合区间作图（compos iteinterval mapping，CIM）进行对大豆细菌性斑疹病和斑点病抗病反应级别的QTL定位及效应检测。进行CIM分析时，选取1cM的步长（walkingspeed），按照假定检测10和Zmapqtl模型3，选取参数为1000次回归，显著水平为0.01。LOD≥2.5时，即认为该区间可能存在一个QTL。运行软件的结果可同时给出性状QTL的加性效应和解释的表型变异。进行MCIM分析时，测试窗口大小为10cM，步速为1cM，采用1000次迭代测验，用F值表示QTL的显著性，在P＜0.05水平下判断该QTL的存在。按照McCouch等的方法对检测到的QTL命名，细菌斑点病用斜体小写字母q加上Rpg，最后是QTL的序号。
QTL关联定位将利用得到的抗病性数据和现有的SNP标记进行分析。应用STRUCTURE软件估测样本群体结构，使用TASSEL软件进行QTL关联分析，具体参考郭呈宇的硕士学位论文：江淮大豆育种种质群体遗传多样性及育种目标性状QTL的关联分析，2012）。
4、可行性分析
（1）试验知识基础牢固、方案设计可行。本人已经完成作物栽培学、作物栽培学实验、植物生理学、植物生理实验、田间统计与试验方法、专业文献阅读、专业文献写作、科技文献阅读等课程的学习，具备一定文献查阅的能力。方案设计思路清晰可行，对相关实验操作技能和要求能够熟练掌握。试验所需时间合理，能够按时完成。
（2）试验与研究条件优良。本研究基于前人的大量研究结果上展开的，具有丰富的理论基础，具有较高的可行性；已获得研究所需的群体和遗传材料；本课题有关研究工作将依托国家大豆改良中心条件；具备实验所需的主要软硬件条件。这些可保障本课题按计划进行研究，并获得预期结果。
（3）试验必要性。不同地区不同品种的大豆，对斑点病抗性是千变万化的，其选种的流程和条件也是不同的。所以，在筛选抗病性较好的品种前，必须要进行相关的抗病性试验，而不能简单的靠猜想和分析。所谓实践是检验真理的唯一标准，只有通过试验，才能准确定位出相关抗病性的基因位点，获得最佳的品种。同时，通过试验，还可以为后续的研究提供数据和资料。通过本试验，可以证实我们的猜想，进一步了解大豆的抗病性，加快相关的研究，克服种子劣变对大豆的影响。而相关的大豆基因QTL定位为人们在分子水平进一步认识大豆的抗大豆细菌性斑点病奠定基础。
4. 参考文献
本实验的创新之处
（1）试验材料有创新。国家大豆改良中心种质创新研究计划中所选育的新品系及亲本所建立的江淮大豆育种种质群体（yhsbgp），共599份。所有品系主要来自南农88-48、南农86-4、诱处4号、南农菜豆5号4个江淮地区优良品种与一批国内外优良品种（品系）及中间材料杂交后代衍生而来。同时利用两个亲本之间抗性有差异的rils群体，定位抗病qtls位点。
（2）思路上有特色。大豆细菌性斑疹病是大豆上危害比较严重的病害，本文通过田间接种试验鉴定抗大豆细菌性斑疹病的优质抗原，并用抗病反应级别定位抗大豆细菌性斑点病的有用qtl位点，为以后抗细菌性斑疹病的遗传育种做可靠的依据。
5. 计划与进度安排
研究计划及预期进展
本申请主要的鉴定试验将在2016年7月到2022年4月进行。具体进度安排如下：
2016.72016.8
