水稻谷蛋白前体增加突变体f968的鉴定与基因定位开题报告

1. 研究目的与意义、国内外研究现状（文献综述）

1.课题的意义：在全世界范围内，有一半的人口以稻米为主食。

稻米不仅可以使人饱腹获得能量，而且可为人体提供丰富的蛋白质。

种子中的蛋白质按照功能分为贮藏蛋白和结构蛋白，结构蛋白种类繁多，但含量极低，故具有营养价值的蛋白质主要是贮藏蛋白。

2. 研究的基本内容和问题

1.研究目标对此水稻蛋白突变体进行表型的鉴定、显微观察，并进行突变基因的精细定位，为后续的基因克隆奠定基础。

2.研究内容2.1表型分析：在灯箱下观察突变体的异常表型； 2.2显微观察：制备突变体及野生型发育胚乳的半薄和超薄切片，比较突变体和野生型间胚乳细胞超微结构的异同，并利用制备的谷蛋白抗体进行免疫胶体金实验，观察细胞中谷蛋白的亚细胞分布；2.3 利用已经构建的f968/dular f2群体对f968进行精细定位；2.4 图位克隆获得突变基因，并构建相应的载体进行转基因互补实验，确认突变基因。

3. 拟解决的关键问题谷蛋白57kd前体的形成、转运及最后经液泡加工酶的特异剪切形成成熟的酸性和碱性亚基途径中的任何缺陷，都将可能导致57kd前体的累积，本文就以f968为研究对象，重点实现f968鉴定和基因的精细定位，图位克隆获得突变基因。

3. 研究的方法与方案

1.研究方法1.1表型鉴定，扫描电镜观察：在灯箱下观察该突变体的异常表型，取野生型、突变体发育12daf胚乳，采用2.5%戊二醛（0.1m ph7.0）4度固定12h后，送生命科学实验中心进行后续处理，采用power tome xl超薄切片机切片，采用h-7650透射电子显微镜观察；1.2 免疫胶体金：取野生型突变体发育12day胚乳，采用4%多聚甲醛 1%戊二醛固定12h，不经锇酸后固定，送生科院中心进行后续处理并切片，按下列程序进行：1) 5% h2o2 漂30min，洗3次，前两次漂洗，最后1次在1.5ml 管中荡洗；（h2o2主要腐蚀切片表面，以利于试剂与蛋白的直接接触）； 2) 在 pbst中荡洗一下（实际上是在 pbst中过一下）； 3) pbst 1% bsa 0.2m glycine 1h (10mg bsa 1ml pbst(含 0.2m glycine))； 4) 加1抗 1：12，先室温 1-2h，然后放入4度冰箱中 24-36h）； 5) pbst洗5 min3（在 1.5ml tube 中）； 6) 1:30稀释金标二抗（pbst 1% bsa用作二抗稀释液）；20ul 580ul 37度2h；7) pbst 5min3，ddh20 5min3，晾干待观察；1.3 dna提取1) 将选取的突变体的叶片剪碎于2ml小管中，加入钢珠并用液氮打碎 ；2) 在小管中分别加入sds 600μl 65℃水浴30min； 3) 加入kac 100ul冰浴30min；4) 加入300-400ul氯仿：异戊醇（24:1）溶液，振荡器上充分摇匀，120rpm，30min；5) 离心，12000rpm，5min，转移200ul上清液于另一离心管中；6) 向上清液中加入2倍体积（400ul）-20℃冰箱20min；7) 弃无水乙醇，风干，加200ul ddh2o溶解，此为dna母液；8) 将母液稀释10倍即为dna工作液。

1.4 标记开发和pcr扩增由上海invitrogen公司合成ssr引物。

pcr反应总体系为10ul，dna 1.5ul，primer1.0ul,10buffer 1.0ul,mgcl2 0.6ul,dntps 0.3ul,rtaq 0.1ul,ddh2o 5.5ul.pcr反应程序为94℃预变性5 min; 94℃变性30 s, 55℃退火30 s, 72℃复性1 min, 35 个循环; 72℃延伸10 min。

4. 研究创新点

蛋白分选与转运是个很复杂的过程，它的正常进行直接影响了植物的生长发育等相关性状，而目前国际上从事水稻谷蛋白转运途径研究较少，且进程较慢，但是谷蛋白转运途径是禾本科蛋白转运的模式系统，研究它具有非常重要的意义。

而本课题中，通过筛选突变体库，获得了一份新的57H谷蛋白突变体，并初步基因定位在chr11上，目前没有相关基因的报道，是研究阐明水稻谷蛋白的转运途径的又一新的重要的材料。

5. 研究计划与进展

研究计划及预期进展1.研究计划1.1 2017年7月至11月：收获f968/dular f2代植株上的种子，磨米鉴定f2代中极端个体（培养基无菌条件下发苗），进行dna提取和ssr标记凝胶电泳，连锁分析粗定位。

1.2 2017年11月至2018年6月：基因的精细定位。

2.预期进展2.1 鉴定f968突变体并精细定位与克隆该基因，为逐步阐明这些谷蛋白合成关键基因的分子作用机理，形成一个清晰的谷蛋白从合成至积累的网络途径做好前期准备，也为水稻的品质改良做好理论基础。