1. 研究目的与意义
鹅掌楸(Liriodendron chinense)，属木兰科(Magnoliaceae)鹅掌楸属，落叶大乔木，为珍稀的第三纪孑遗树种。鹅掌楸干形通直、生长快、材质好、叶形奇特、观赏价值高。由于地理变迁、残存种群生态系统的变化、树种本身的生物学特性、天然群体种子萌发率低以及人为因素等影响，导致中国鹅掌楸目前处于濒危状态。 9-顺式-环氧类胡萝卜素双加氧酶(NCED)催化9-顺式-紫黄质或9-顺式-新黄质产生黄质醛, 被认为是ABA合成中的一个关键酶,并对ABA的合成调控起到了十分重要的作用。ABA作为一种重要的植物激素，对植物的生长、发育及适应性有重要作用。因此对脱水素相关基因的研究可以为鹅掌楸的抗寒、抗旱、抗盐渍等的进一步分析奠定基础，提高鹅掌楸的适应力。
2. 国内外研究现状分析
Tan等于1997年在脱落酸缺乏突变的胎生玉米种子中，通过转座子诱变，第一次鉴定出涉及脱落酸生物合成的类胡萝卜素裂解氧化酶基因-VP14。其编码的蛋白与动假单胞菌的LSD(lignostilbene dioxygenase)具有很高的序列同源性。而LSD催化与脱落酸合成过程中类胡萝卜素裂解类似的一个双键裂解反应。重组VP14蛋白分析结果显示，VP14酶通过在11、12(11'、12')共扼双键位置将C40类胡萝卜素催化形成脱落酸的前体物质一C15黄质醛，进而调控脱落酸的合成。因VP14酶首选底物为具有环氧结构的9-顺式-紫黄质(9-cis-violacanthin)和9-顺式-新黄质(9-cis-zeaxanthin)，因此VP14酶又称为9-顺式-类胡萝卜素双加氧酶(NCEDs，9-cis-epoxycarotenoid dioxygenase)。基于VP14酶同源性分析，鉴定出多种参与类胡萝卜素裂解的氧化酶。Tan等在拟南芥全基因组中共鉴定出9个编码CCOs的成员。中5个编码的酶与VP14酶具有较高的同源性而称为NCEDs(AtNCED2、AtNCED3、AtNCEDS、AtNECD6、AtNCED9)。
从这之后，NCED基因相继在番茄、菜豆、拟南芥与花生中被克隆和功能鉴定。Thompson等研究发现番茄叶片中的LeNCED1基因受水分胁迫诱导而表达，其表达量有昼夜节律性的变化。Iuchi等将NCED基因转化拟南芥和烟草后，提高了转基因植株内源ABA含量并且增强了植株的耐旱性。Oussama等分析了CstNCED基因在山梨醇、盐、低温、干旱、外源ABA等处理下的表达模式，发现CstNCED基因可以被山梨醇、干旱、低温以及盐处理诱导。Wang与Luchi发现拟南芥At-NCED3基因的表达能够被干旱胁迫诱导，并且证实AtNCED3基因的过表达能够提高植物的耐旱能力。干旱与盐胁迫可以诱导水稻OsNCED3基因在根与叶片中表达，其中干旱胁迫可以诱导OsNCED3基因在根与叶片中的表达量升高93与161倍，但在种子与花中并无表达。综上，关于NCED基因的表达调控以及该基因在逆境信号转导中的作用已有较多研究。近年来关于NCED基因的研究主要集中在植物抗逆机制和信号传导上，目前关于NCED基因的研究大多集中在其对干旱胁迫的调控方面。超表达NCED基因能增加植物对干旱的抗性。
3. 研究的基本内容与计划
3.1 研究内容
本课题从鹅掌楸est数据库中寻找具有相关功能的序列，利用oligo7设计特异性引物，采用rt-pcr和race 技术，得到从鹅掌楸中克隆得到lcnced1基因的全长。利用ncbi网站的orf finder工具，确定该基因的开放阅读框。利用ncbi网站的blastx工具进行其他物种的同源氨基酸搜索，利用dnaman软件对同源氨基酸进行多重比对，clustalx和mega 4.1软件构建系统进化树。用在线分析生物软件expasy和dnaman对鹅掌楸lcnced1基因编码的蛋白质的一级结构进行分析；利用antheporot 软件分别利用 gor、gib、lev、dpm 这四种算法对鹅掌楸lcnced1基因编码的蛋白进行二级结构的分析；利用在线生物软件对lcnced1编码的蛋白质的三级结构进行预测。
3.2 计划
4. 研究创新点
NCED基因是ABA合成中的一个关键酶基因，对植物的生长、发育及适应性有重要作用，本论文以鹅掌楸为材料克隆LcNCED1基因，并对其编码蛋白结构进行预测，这在以往的研究中鲜见报道。
