松材线虫MicroRNA的分离及cDNA文库的构建开题报告

1. 研究目的与意义

microrna是一种内源的并且是种群间相对保守的小rna序列，并且在发育、细胞增殖、凋亡、脂类代谢、激素分泌及肿瘤发生等多种生理和病理过程中发挥重要的调节作用。

关于mirna的功能及作用机制的研究是当前生命科学研究的热点。

本实验旨在对松才线虫体内的mirna进行分离，同时对于松树线虫体内所带有的全部mirna对照实验室培养基上生长的线虫体内的mirna进行对比分析，希望能够发现与致病性相关的一些松材线虫mirna.

2. 国内外研究现状分析

国内：目前，迄今为止,在植物、线虫、果蝇和哺乳动物中已发现了一千多个miRNA基因。对miRNA 表达的鉴定主要依靠以杂交和 PCR 为主的相关方法。对其功能线索的获得，则主要依赖于在特定细胞或动物模型内外源性抑制或表达相应的miRNA基因，再通过报告基因系统验证后检测特定细胞或动物模型发育过程中的生化或分子变化来实现。并同时利用报告基因系统对miRNA的靶基因进行验证。

国外：今年来随着高通量测序的诞生，miRNA的研究进入了一个新的阶段，通过高通量测序，越来越多的miRNA被发现，最新发现的是线虫上的21UmiRNA。通过这一技术我们将更容易对于线虫体内的miRNA进行研究和探索。

3. 研究的基本内容与计划

2011.2~2011.3 松材线虫mirna的分离纯化 使用mirvanatmmirna isolation kit对所保存的线虫进行小rna的提取及纯化，再经过15%聚丙烯酰胺胶电泳并在marker的对照下切去19-24nt的凝胶，分离纯化后得到需要的松材线虫mirna。

2011.2~2011.4 松材线虫mirna接头反应 克隆是分析低分子rna的有效方法之一。

由于低分子rna不具有polya tail，需在低分子rna的5端和3端分别加上rna接头或者rna/dna 杂合形式的接头，经rt-pcr后便可进行克隆。

4. 研究创新点

首次对于松材线虫与寄主松树互作过程中的miRNA数量及种类的变化进行研究，为以后的特异miRNA的功能分析及验证打下了基础。