利用miRNA-RACE确定生物信息预测的葡萄的 vvi-miR156精确的序列开题报告

本课题的意义、国内外研究概况、应用前景等（列出主要参考文献）

1.选题背景

microRNA（miRNA）是一类约22个核苷酸长度的非编码小分子RNA，广泛存在于真核生物中，通过和靶基因的互补配对而降解mRNA或抑制翻译的起始。本文从miRNA的生物信息学预测、miRNA的鉴定、高通量测序、靶基因鉴定等方面介绍miRNA在果树的发育过程中的作用，并展望其生物学功能和调节机制的研究前景。目前，有关果实中miRNAs的研究还主要集中在果实miRNAs的鉴定、靶基因预测及miRNAs表达特性与果实生长发育的关系等方面。

生物信息学预测miRNA的实验验证主要是用northern杂交、基因芯片或RT-PCR检测。Wang等基于不同葡萄品种上高通量测序的同源序列存在的差异，利用miR-RACE技术对生物信息学预测的162条（88unique序列）葡萄miRNAs在夏黑品种上进行验证，83条被成功地验证,并随机对其中的10条miRNAs及其靶基因进行定量PCR表达图谱分析，发现miRNAs与其靶基因在表达水平上呈现一定的消长关系，表明这些miRNAs可能负调控其靶基因^[1]。

2.选题题目的与意义

在植物中为了鉴定miRNA功能，进一步确定其靶基因是非常必要的。目前，植物上靶基因预测最有效的工具，是基于miRNA与靶序列在的高度同源性用生物信息学方法来寻找^[2]。在预测植物miRNA的靶基因上，这种方法已经被试验验证是切实可行的^[3].目前寻找植物中靶基因最高效的方法是利用miRNA和的靶序列高度同源性进行生物信息学预测^[2].基于miRNA与靶序列完全或近乎完全的互补特性，在总共从15个柑橘miRNA中找到 41个潜在的靶基因^[4]。其中的四个靶基因在枳中mRNA水平上已被实验证实在被miRNA剪切。Xu等从甜橙60个miRNA靶标预测418靶基因,比较了柑桔果实的红肉突变体与野生型果实miRNAs的差异^[5]。 最近几年：miRNA的研究获得了巨大的进展。miRNA的预测程序和鉴定技术的结合：为我们打开了通向基因调节世界的大门。敏感的生物学鉴定技术可以指导预测程序的微调，而这些技术的发展又依赖于有效的预测程序。

miRNA作为一种新近发现的小分子调控RNA，其在生物体内起着十分重要的作用。关于miRNA各方面研究也在如火如荼地进行着。在miRNA的生物合成过程中，还有很多疑问没有被解决，例如，miRNA基因在转录水平的调控，虽然有报道在线虫miRNA基因的上游~200nt的位置找到了一段保守序列（CTCCGCCC），但是在其他生物的miRNA中却没有找到这段序列，是不是还有其他的保守序列呢？有证据表明，许多人类miRNA位于基因的不稳定区域，而这些不稳定区域恰恰是跟癌症、突变等疾病紧密联系的。

3.应用前景

植物中的miRNA及其对植物生长发育的影响是植物生物学研究领域中的一个热点，它为植物生物学的研究提出了新的研究思路。但是随着研究的深入，越来越多的问题摆在人们面前有待解决，目前植物miRNA研究遇到的几个关键问题：一个大的方面是miRNA的功能研究。现在我们在不同的植物中已经克隆了很多的miRNA，其中有些是高度保守的，有的是种属特有的。下一步的任务就是阐明它们的生物学功能，研究它们的表达调节机制。另一个方面就是miRNA的加工。目前我们对植物miRNA的具体加工过程还不完全清楚。第3个方面是miRNA的进化研究。miRNA是如何进化出来的，是如何演变的也是将来工作的一个重点。

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研究的目标、内容和拟解决的关键问题

1.研究目标

到目前为止，植物中miRNA数以百计的被报道，这些miRNA中很大一部分是用生物信息学方法预测的。然而，与编码蛋白质的基因有起始密码子和终止密码子相比，miRNA分子的两端没有任何特征可以用来确定miRNA成熟体序列，这使生物信息学方法预测miRNA往往不能确定成熟的miRNA在前体中的精确位置。利用miR-RACE生物信息学预测的葡萄的miR156精确序列。本研究构建了葡萄小RNA文库，miRNA的5'RACE、3' RACE和RACE产物的克隆测序。结果表明利用这种有效的新的方法分别验证了葡萄中生物信息学预测的葡萄的miR156精确序列的精确序列。进一步利用RLM-5' RACE来验证miR156对其靶基因的剪切和荧光定量RT-PCR来研究精确序列的表达。这种方法可以克服生物信息学法预测miRNA的的主要缺点不能确定miRNA在前体上的精确序列，可能是miRNA研究非常有用的工具。

2．研究内容

miRNA是第一类被发现并具有重要功能的内源单链小分子 RNA。每种植物中有上百个编码 miRNA 的基因（不同物种中的具体数目不一样），它们分别在植物的不同器官和不同发育阶段表达。通过传统的Sanger测序法鉴定数百个编码miRNA 的基因，而生物信息学预测得到了更多的miRNAs。这些方法主要是使用其前体发夹结构搜索ESTs和现有基因组序列来寻找miRNAs （Zhang et al., 2006; Jaillon et al., 2007; Griffiths-Jones et al.,2008; Meyers et al., 2008; Sunkar and Jagadeeswaran, 2008）。生物信息学对miRNA进行预测和鉴定有着试验生物学无法比拟的快速和方便的优势而备受青睐（Zhanget al., 2008）。尽管生物信息学预测miRNA根据miRNA保守、长度为21nt左右和其前体发夹结构，通过设置各种参数使预测的miRNA的假阳性已降到最低，精确的序列通常无法确定几个候选的同源或旁系同源miRNA，可能预测的miRNA是一个特定的miRNA。

据我们所知，没有系统全面的方法，以确定这些miRNA的精确序列。我们开发了一个综合性的实验方法，结合了小RNA cDNA文库的构建（Song et al., 2010），miRNA的5'RACE和3'RACE来扩增miRNA的两个末端以及RACE产物的克隆测序。我们开发的方法包括以下主要步骤：一、miRNA文库的构建；二、miR-5'RACE 和miR-3'RACE分别扩增miRNA的5'末端和3'末端；三 、miR-RACE产物的克隆和测序；四、用实验确定了的miRNA156序列进行荧光定量PCR；五、qRT-PCR产物进一步克隆测序以验证定量PCR产物的真实性。我们方法创新的核心步骤是两个PCR反应扩增miRNA5'RACE和3'RACE特异引物的设计包括候选的miRNA部分序列和接头序列。正因为我们的方法是用来验证miRNA5' 和3' 末端类似于传统的RACE技术，因此我们给我们的方法命名为miR-RACE。我们使用这种方法验证了葡萄中生物信息学预测的miRNA156的精确序列。

研究方法、技术路线、实验方案及可行性分析

1. 研究方法

葡萄的幼叶、嫩茎、根、花芽、花和果（直径0.50 cm）的提取参照第二章，葡萄和苹果总RNA提取用的是改良的CTAB法（李志强等,2008），小分子RNA的富集参照第二章用4M的Licl。

2．技术路线

小分子RNA定量与完整性检测，→ ploy（A）小分子RNA5' 接头的连接 → cDNA第一链的合成 → miR-5' RACE和miR-3'RACE扩增，→ miRNA172目的片段的回收，→ 目的片段与载体的连接，→ 目的片段的转化及克隆鉴定，→ 荧光定量PCR检测新的miRNA。

3.实验方案

葡萄miR-5'RACE和miR-3'RACE

为了扩增葡萄miRNAs的5'末端和3'末端，我们构建了葡萄根、茎、叶、花和果混合样的小RNA miRNA文库（图3-2A, Fu et al., 2005），扩增5'和目标miRNA的3'端，用类似于类似的cDNA末端快速扩增（RACE）技术的miR-5'RACE和miR-3'RACE 分别扩增miRNA的5'末端和3'末端。第一个参数是，引物覆盖的17个核苷酸的成熟miRNA的候选序列，而这些特异的17个核苷酸的miRNA与相应的符合用于常规PCR引物的核苷酸的最低数量标准。第二个参数是特异性引物序列和真实miRNA的序列2-3个碱基的错配是被允许的，这些不影响错配的PCR扩增，在定点突变以及重组DNA技术引入限制性内切酶扩增DNA，也是用类似的原则（Peng et al., 2006; Kovalic et al., 1991）。

葡萄miR-RACE扩增产物的克隆测序

葡萄miR-5'RACE和miR-3'RACE产物分别进行回收、克隆和测序，每一个独立的克隆至少测序3次以上，再把克隆正确的产物进行两个接头的拼接分别得到9个miRNA的全长序列（表1）。从而说明miRNA序列的进化性以及序列保守性。与第二章生物信息学预测的ptr-miR171b，ptr-miR482a和ptr-miR482b序列的5'和3'末端有相应的变化相比，我们的miR-RACE确定了5'和3'末端序列。

4.可行性分析

miR-RACE验证的葡萄miRNA保守和变异性分析

从表1中可以看出vvi-miR156a，vvi-miR156b，vvi-miR156c我们的测序结果与拟南芥相应的miR156a，miR156b，vvi-miR156c序列完全一致，从而说明葡萄的这3个miRNAs的高度保守性以及我们实验方法的可行性。

葡萄miRN156的表达分析

为了进一步验证克隆序列的准确性，本研究采用克隆miRNA一样的方法来构建葡萄的根、茎、叶、花和果的小RNA的cDNA文库（Fu et al., 2005），采用PAP加尾法（Shi et al., 2005）进行荧光定量PCR来检测克隆正确的miRN172在葡萄各种器官的表达分析。图2表达结果表明所有克隆测序的miRNA在葡萄的根、茎、叶、花和果都有表达，但是不同的器官中呈现出一定的表达差异，有的miRNA表现出器官、物种或不同生长发育时期的表达特性。

5．特色或创新之处

miRNA作为一种新近发现的小分子调控RNA，其在生物体内起着十分重要的作用。关于miRNA各方面研究也在如火如荼地进行着。在miRNA的生物合成过程中，还有很多疑问没有被解决，例如，miRNA基因在转录水平的调控，虽然有报道在线虫miRNA基因的上游~200nt的位置找到了一段保守序列（CTCCGCCC），但是在其他生物的miRNA中却没有找到这段序列，是不是还有其他的保守序列呢？有证据表明，许多人类miRNA位于基因的不稳定区域，而这些不稳定区域恰恰是跟癌症、突变等疾病紧密联系的。这么多的miRNA为什么会偏偏处于这个区域呢？同样在植物中是不是也有类似的情况呢？miRNA作为一种调控因子，它本身的表达又由什么来决定呢？还有，动物当中miRNA末端的决定是由Drosha在对初级转录产物进行第一次切割的时候就决定了，而在植物中这一过程是由DCL1决定的，鉴于Drosha切割的特异性，因此成熟的动物miRNA可能要比植物中的miRNA更为保守，从序列上讲更加精确，这是否与多数动物miRNA与靶mRNA不完全配对抑制mRNA的翻译，而植物的miRNA通常与靶mRNA几乎为完美配对从而导致mRNA的降解有关呢？miRNA与靶基因的不完美的互补是不是miRNA对靶基因发生作用机制做必备的？这些谜团都需要对miRNA做再深入的研究才能找到答案。对于miRNA成熟过程的研究，不仅可以使生物体的调控网络更加细化，还可以通过对这一过程进行人为的干预，从而进一步研究在不同物种中miRNA的功能及其起源等问题。

研究计划及预期进展

生物信息学方法鉴定miRNA和靶基因的基本原理主要是根据miRNA 保守、长度为21nt左右及其前体发夹结构等特征，以及miRNA和靶基因完美或近完美的匹配来预测和鉴定在以往的研究中，生物信息学鉴定miRNA后为了验证其存在，通常是根据生物信息学预测的序列直接设计特异引物和另一个接头引物进行扩增（Xie et al., 2007; Wang et al., 2009），然而，这种特异引物扩增无法验证出那些进化的非保守的miRNA，特别是miRNA的5'末端和3'末端发生变化时，那些miRNA的精确的序列。这是因为生物信息学预测的miRNA与真实的miRNA即使有几个核苷酸序列不同，但是特异性引物也能扩增出完全相同的序列。

在老师和师兄师姐们的帮助下，已经开始做实验了，打算五月初完成实验。