蝴蝶兰PhFT 基因对拟南芥的遗传转化及转基因植株的表型分析开题报告

全文总字数：7237字

1. 研究目的与意义、国内外研究现状（文献综述）

一、课题意义

蝴蝶兰属于兰科蝴蝶兰属（Phalaenopsis），因其花期长、花色丰富、花姿优雅，素有“洋兰皇后”之称，从而受到了大众的喜爱，得到了广泛栽培，在年宵花卉市场上占有一席之地。根据农业部公布的2015年全国花卉统计数据显示，我国蝴蝶兰种植面积543.93公顷，年销量1744.56万盆，产值26443.46万元，平均价格达15.16元/盆（旷野，2016），具有较高的商业价值。由于春节期间是蝴蝶兰的销售旺季，因此蝴蝶兰的花期调控对其经济价值具有十分重要的影响。

蝴蝶兰自然花期在每年的3～5月，目前蝴蝶兰花期调控主要通过温度调节来实现。利用空调、喷雾降温等设备可以对发育成熟的蝴蝶兰植株进行低温处理，处理条件为昼温25～27℃，夜温18～20℃，昼夜温差需保持在6～8℃。低温处理约30～45d即可完成花芽分化（刘晓荣等，2005）。由于此方法对设备要求较高且成本较大，一些地区采用高山栽培来实现蝴蝶兰的低温催花。一般选择8～9月上山栽培，至10月中下旬下山进行温室栽培，可促进蝴蝶兰花芽分化（卢兴霞等，2011）。这种方法极大地缩减了降温成本，但是受到了地域的限制，且催花效果也会受到海拔高度、光照条件等因素的影响，效果不稳定。此外，激素处理对蝴蝶兰花芽分化也有一定的影响。研究表明一定浓度的BA和GA同时处理可以促进腋芽发育为花芽，但会引起小花数减少且有一定数量的小花产生畸形（小西国义，1992）。

目前对蝴蝶兰花期调控的研究已有一定的进展，但是对蝴蝶兰花期调控的分子机制的研究还不够深入，成花机理尚未明确。目前，小兰屿蝴蝶兰（Phalaenopsis equestris）的基因组信息已经公布（2N=2X=38）（Cai et al., 2015），并重新进行了转录组数据的组装（Niu et al., 2016），这为研究蝴蝶兰的开花关键基因及其作用机理的研究提供了重要的参考依据。

针对以上问题，本课题在现有的工作基础上，深入发掘蝴蝶兰的开花关键基因，并解析其作用机理和调控网络，不仅可以为蝴蝶兰生产中的花期调控提供理论依据，也可以通过缩短蝴蝶兰的生长周期从而培育出更多新品种，提高我国在兰科花卉生产和研究中的竞争力。

二、国内外研究概况

1.国内外开花相关基因研究动态

(1)植物开花过程

植物开花过程通常分为4个阶段：（1）成花诱导阶段，该阶段是植物经过营养生长后，在内因和外因的诱导下由营养生长向生殖生长转变，形成花序分生组织的过程；（2）由花序分生组织形成花分生组织的阶段；（3）由花分生组织形成花器官原基的阶段；（4）花器官的发育和成熟的阶段（Alvarez-Buylla et al.，2010）。其中，成花诱导阶段是植物发育的第一步，也是植物开花过程最关键的阶段。目前，在拟南芥中已确定7种成花诱导途径，包括赤霉素途径，自主开花途径，春化途径，光周期途径，温度途径，生物钟途径，年龄途径等（Blümel et al., 2015）。不同的途径诱导不同的开花相关基因的表达，不同的开花相关基因之间相互作用，构成了复杂的花期调控网络。其中，FT/TFL1基因发挥了重要作用。

(2)开花过程关键基因FT/TFL1

FT/TFL1基因属于PEBP家族，包括3个亚家族：FT亚家族、MFT亚家族和TFL1亚家族。

拟南芥的FT基因在叶片中表达，FT蛋白通过韧皮部从叶片运输到茎顶端分生组织并与FD蛋白互作，进而促进开花（Corbesier et al., 2007; Abe et al., 2005）。FT功能缺失会延迟拟南芥开花。MFT与FT功能冗余地促进成花转变，过量表达MFT导致拟南芥开花提前，mft单突变体则不影响开花时间（Yoo et al., 2004）。TFL1少量积累于顶端分生组织；而在成花诱导阶段，TFL1在顶端分生组织中大量表达。在tfl1突变体中，不仅出现早花现象，还会引起拟南芥花序由无限生长向有限生长模式转变。过量表达TFL1会延迟开花并抑制IM向FM的转变。AtTFL1基因通过抑制下游开花因子LFY和花分生组织基因APETALA1（AP1）、CAULIFLOWER（CAL）的表达而抑制开花（Hanano and Goto, 2011）。

尽管FT与TFL1具有高度一致的氨基酸序列（60%），但其生物学功能却截然相反。决定拟南芥FT与TFL1基因生物学功能差异的位点包含两个关键氨基酸残基的变化，即FT第85位氨基酸为酪氨酸（Tyr）/TFL1第88位氨基酸为组氨酸（His）和FT第140位氨基酸为谷氨酰胺（Gln）/TFL1第144位氨基酸为天冬氨酸（Asp）（Hanzawa et al., 2005; Ahn et al., 2006）。

FT/TFL1的同源基因已在多个物种被克隆，包括双子叶植物的番茄（SFT/SP）和月季（RoFT/RoKSN），以及单子叶植物的水稻和玉米等，不同物种FT/TFL1受光照和温度等环境因素调控，这些基因功能总体保守，但又各有新的功能（Wickland and Hanzawa, 2015）（表1）。

表1 不同物种中FT/TFL1同源基因的功能

（3）蝴蝶兰开花基因克隆及功能研究

在蝴蝶兰中，已经报道的与开花相关的基因包括FT-like、CO-like和LFY-like等同源基因。PaFT1是蝴蝶兰FT/TFL1-like家族基因之一，其与拟南芥和水稻FT同源基因的序列高度一致。研究表明PaFT1参与蝴蝶兰开花调控并受到低温诱导而不受光周期诱导，这与模式植物中FT基因参与的光周期途径调控不同，推测蝴蝶兰FT/TFL1-like家族基因可能通过不同的作用机制参与成花转变（Jang et al., 2015）。在烟草中异源表达蝴蝶兰CO-like同源基因PhalCOL同样地引起早花现象，表明PhalCOL也参与蝴蝶兰的成花转变过程（Zhang et al., 2011）PhapLFY基因主要在花序原基中的花原基表达，并能恢复拟南芥lfy突变体的表型，将其过量表达到水稻中引起水稻早熟的现象（Zhag et al., 2010）。

虽然上述开花基因参与蝴蝶兰开花调控已被报道，但蝴蝶兰的开花调控分子机理及开花基因调控网络尚不清楚。因此，明确FT/TFL1-like家族基因是如何调控蝴蝶兰成花转变的分子机理是值得深入研究的发育生物学课题。

参考文献：

旷野. 花卉生产平稳，内销增长明显——2015年全国花卉统计数据分析[J]. 中国花卉园艺, 2016(15):38-42.

刘晓荣, 王碧青, 朱根发,等. 影响蝴蝶兰生长发育的环境因子及花期调控研究进展[J]. 西北农业学报, 2005, 14(4):81-85.

卢兴霞, 王丽娟. 我国蝴蝶兰花期调控的研究进展[J]. 北方园艺, 2011(17):215-217.

小西国义. 花卉花期控制[M]. 淑馨出版社, 1992.[1]

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Lifschitz E, Eviatar T, Rozman A, et al. The Tomato FT Ortholog Triggers Systemic Signals That Regulate Growth and Flowering and Substitute for Diverse Environmental Stimuli[J].

2. 研究的基本内容和问题

研究的目标：

在拟南芥中异源表达ft/tfl1-like家族基因进行表型分析和功能互补验证。

研究的内容：

3. 研究的方法与方案

研究方法

本研究利用植物双元表达载体pcambia1302，通过酶切、连接、转化等构建35s: ft/tfl1-like正义过量表达载体，测序验证后转入农杆菌eha105中备用；利用蘸花法侵染拟南芥野生型，通过潮霉素筛选和pcr验证获得转基因阳性植株；在拟南芥突变体ft、tfl1、mft中过表达ft/tfl1-like家族基因；通过统计转基因植株开花前叶片数量、开花时间、花序分枝特性等生理指标，对ft基因进行初步分析。

4. 研究创新点

目前国内外对蝴蝶兰花期调控的分子机制的研究还不够深入，成花机理尚未明确。本课题在现有的工作基础上，深入发掘蝴蝶兰的开花关键基因，并解析其作用机理和调控网络，不仅可以为蝴蝶兰生产中的花期调控提供理论依据，也可以通过缩短蝴蝶兰的生长周期从而培育出更多新品种，提高我国在兰科花卉生产和研究中的竞争力。

5. 研究计划与进展

2018.7-11: 侵染拟南芥，在拟南芥突变体ft、tfl1、mft中过表达ft/tfl1-like家族基因。

2018.11-12:开始测定各项生理生态指标。

2019.3-5:分析数据，完成毕业论文撰写。