荧光素分子荧光探针监测活细胞pH变化外文翻译资料

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荧光素分子荧光探针监测活细胞pH变化

Rui Wang, Chunwei Yu, Fabiao Yu, Lingxin Chen

摘 要：合成荧光探针的可行性和新而有效途径的显微镜检查法的发展使得荧光显微镜检查法成为生物医学科学和生物学的一种必要工具。细胞内的pH在生理学和病理学过程（如接受体间接的信号传导作用，细胞生长和细胞凋亡，离子传输和体内平衡）中扮演重要角色。由于一个H 受体连接了荧光基团，一些小分子荧光探针监测出pH灵敏吸收和荧光发射。这些行为被用于设计用于研究体内pH规律的pH指示剂。该综述总述了新的分子荧光pH探头及其在生物医学和细胞生物学中的应用，尤其是在设计并合成小分子探针在监测活细胞pH变化中的应用。

关键词：荧光显微镜技术；荧光探针；细胞内pH；活细胞；有机合成；pH检测；pH指示剂；pH规律；信号传递；小分子探针

1.前言

由于补丁内的荧光发射可以不经直接接触而被检测，这种检测法可以做到非入侵性[1]。非侵入性测量具有的优势，包括高灵敏度，选择性好，响应时间短，实时监控，并且可以原位观察[2]。有机合成化学进一步加强科学的许多领域，因为有机合成技术可以实现清洁地形成新的理想化合物[3]，所以一个有计划的有机合成策略可以成功地解决复杂的生物医药学问题。各种合成荧光探针的可用性和新的有效的显微镜检查法[如，共聚焦激光扫描显微镜检查法(CLSM)]的发展给予荧光显微镜检查法在生物医学科学和生物学中必要和重要的地位[4]。从这个角度出发，合成化学和生物成像之间的共生关系继续推动探针设计和仪器的协同发展[5]。

荧光pH探针在发射光谱的变化和荧光强度上通常受到光学变化的影响[4]，但在研究各种生理和病理过程方面他们已被证明是有效的工具，包括接受体间接的信号传导作用，酶活性[6]，细胞生长和细胞凋亡[7]，离子传递和体内平衡[8]，钙调节，胞吞作用，趋化作用，和细胞粘附[9]。与微电极技术相比，他们也得到更大的空间采样能力和非侵入性测定[4,10]。

在正常生理条件下，细胞外氢离子浓度被保持在非常窄的范围。在pH7.4正常值为约40 nmol / L而在pH范围为7.35-7.45时正常值变化约5 nmol / L。在任一方向上偏差0.10-0.20个pH单位可引起心肺和神经问题[如，阿尔茨海默病(Alzheimerrsquo;s disease)][11,12]，并且更极端的变化可能是致命的[12]。因此H 是生物医学领域感兴趣的物种中最重要的目标之一。

本综述中的新分子荧光pH探针和它们在生物医学领域和细胞生物学应用的发明总括了它们的进展，特别是设计并合成小分子探针用于监测活细胞中pH值变化。我们回顾了化学的工具和策略可行性。我们也总结了从探测的发展和应用的角度出发在这一领域的当前和未来的挑战。

2.设计H 响应分子荧光探针

为了量化pH值，探针的pK_a与研究系统的pH相匹配是重要的[4]。在这方面，这些生物pH探头可分为两种类型：

1. 细胞质，其在pH值6.80〜7.40间工作；和
2. 酸性细胞器（如，溶酶体和内涵体），在pH值4.5-6.0间工作。

在这种检测的条件下，我们强调的是无论是近中性或酸性时，理想的探针应该显著地响应微小的pH变化，并得到可靠的结果，同时特别是避免从天然细胞物种的干扰。因此，有效的监测pH值变化的荧光探针必须满足一些严格的要求，包括选择性好，灵敏度高，光稳定性好，并具有在适当的pH值范围内工作的能力。更重要的是，这种探针对H 的选择性应超过其他生物核素。探针必须与适合于所研究的系统的酸离解常数（pK_a值）相匹配。此外，高荧光量子产率可降低所需的细胞应用的染料量，并且使细胞内物质的分布的影响最小化。为了使光损失最小化并避免细胞的自发荧光的影响，长波激发和发射的荧光团是合乎需要的。最后，探针还必须与生物系统兼容（如，水溶性和低生物毒性）。

在这种探测器的设计中，要注意识别和荧光基团两个部分[13]。荧光团部分用作信号转换器，其将识别信息转换成光信号的变化。通常采用操作机械[如，电荷转移（charge transfer，CT），光诱导电子转移（photo-induced electron transfer，PET）单体准分子，和电子能量转移（monomer-excimer, and electronic energy transfer，EET）][14]。

至于识别部分，它承担有效率地选择和结合被分析物的责任。值得指出的是，荧光团部分可以通过一个间隔基或不被链接到识别部分上的问题。即使在后一种情况下，荧光团的一些原子可以参与络合，因此在光信号的变化常常由整个分子结构导致，包括荧光团和识别两个部分。

3.氯化荧光素

荧光素，最常见的荧光试剂，具有高消光系数，极好的荧光量子产率，良好的水溶性和无毒性。它的荧光激发和发射光谱在可见区[15]。荧光素衍生物的使用可以测定单个细胞内的pH[16]。然而，相对宽的荧光发射光谱限制了它们在多色应用中的效用[4]。此外，荧光素在pH范围5.0-8.5发挥作用时，荧光强度仅在pHgt;8.5时达到其最大值，因为酸性细胞的pH值范围是4-6，所以精确的pH测定不能在酸性细胞实现。

芳族氢的氯选择性取代可以改变化合物的光物理性质[17]。Ge等人 [18]合成的氯化荧光探针1 - 3以解决上述问题。这些化合物在pH范围3.5-7.0内表现出对pH值的强依赖性，并且1和2的pK_a6.34和3的pK_a4.64低于其相应荧光素的。在生理pH范围6.8-7.4荧光强度最大可以达到。不幸的是，这种探针尚未应用于测量酸性细胞。此外，为了增加细胞渗透能力这些化合物需要被修改为荧光素二乙酸酯。

荧光素可以迅速地从细胞渗出，这使得它难以量化细胞内pH变化。为了消除染料从细胞内的渗出，Bradley等人[19] 结合荧光素共价到聚苯乙烯微球。荧光微球探针4用于实时感测活HEK293T，B16F10和L929细胞的pH。

4. 若丹明染料

若丹明（Rhodamine ，Rh）染料作为分子探针在细胞生物学中被广泛的应用。这种染料具有优异的光物理特性（例如，高消光系数，良好的光稳定性，高荧光量子产率，并且它们的吸收的细长波长和发射到可见光区）。它同时具有良好的细胞隔膜渗透性。基于若丹明 B（Rh B），Tang等人[21]设计并合成了酸性荧光探针5。检测机理为Rh染料的螺环（非荧光）和开环（荧光）构象之间的转化。该探针的荧光强度在pH4.2-6.0之间的变化超过100倍。它的pK_a为4.85。所设计的探针被应用于监测活HepG2细胞内的H 。

Rh B已被Hasegawa等人[22]改性成beta;-环糊精（beta;-cyclodextrins ，beta;–CD）。beta;–CD在客体分子中扮演无毒性的角色，而Rh B 作为荧光部分。探针6监测海拉细胞中的pH。MTT试验表明相比于Rh B，6和7有较低的细胞毒性。

5.近红外花青染料

近红外（Near-infrared，NIR）荧光花青染料在生物医学的现代成像技术中变得越来越重要[23]。这些染料具有较高的消光系数（gt;20万升/摩尔/厘米），宽光谱响应，良好的荧光性和高光稳定性。荧光发射波长位于近红外区域（gt;600nm），可以最大限度地减少光损失并避免细胞自发荧光的影响。

Tang等人[24]选择花青染料作为荧光基团并用PET机理合成了两种pH探针AP-Cy（8）和Tpy-Cy（9）。AP-Cy是一个双重的NIR pH荧光探针。其荧光调制器是3-氨基苯酚，其pK_a值在酸性条件下为5.14，在碱性条件下为11.31。AP-Cy被用于HepG2细胞的pH成像。Tpy-Cy pK_a值约为7.1，需要三联吡啶(terpyridine，Tpy)作为H 受体。该探针已成功用于活HepG2和HL-7702细胞的pH值实时成像和pH的原位检测。

Galande等人[25]报道了一个氨基胜胨酵素N（APN）目标荧光pH探针10（CY5G2）。Cy5被选作荧光基团。由于自猝，该探针在生理pH为7.4时表现出弱荧光，而在pH为4.5时荧光增强。因为APN在肿瘤血管中的过度应用，CY5G2在监测癌细胞pH变化上表现出潜在应用。

Lee等人[26]论证了近红外荧光pH灵敏探针11（pK_a值约为3.5）的一种非常规巴比妥酸盐间接合成。该荧光pH探针的结构特征提出了一种新颖的取代/消除途径，这是不同于七甲川染料（heptamethine dyes）的内消旋氯原子使用的非常确定的S_N1机理途径。

Hilderbrand等人[27] 用HCyC-646和Cy7染料标记噬菌体颗粒获得一个近红外荧光比例pH探针12。Cy7的放射在pH5-9的范围内保持稳定。然而，pK_a值为6.2的HCyC-646的放射信号随pH的变化而变化。该探针用于细胞内检测和通过光漫射的生物组织的红外基础pH成像。

Povrozin等人[28]研究了一种工业pH灵敏染料Square-650-pH (K8-1407)。该探针的吸收和发射都在近红外区。与质子化形式（protonation form）相比，去质子化形式（deprotonation form）在激发光谱上显现蓝移。在抗体上标记，蛋白质缀合的构象在这种染料上的行为不同。游离探针具有7.11的pK_a值，而抗体结合的标签的pK_a值为6.28。缀合探针和微生物的新方法在研究吞噬细胞事件和监测细胞pH变化上表现出巨大的潜力。

6. 4,4-二氟-4-硼-3alpha;，4alpha;-二氮对称引达省染料

4,4-二氟-4-硼-3alpha;，4alpha;-二氮对称引达省(4,4-difluoro-4-bora-3a,4a-diaza- s –indacene，BODIPY)染料往往是在体内可连接于蛋白质的优良标签。这个荧光团具有一些特性，包括高消光系数（egt;80000/cm/ M），尖锐的荧光峰，高量子产率，并且对溶剂的极性和pH值相对不敏感，这使得它成为荧光素在某些成像技术的潜在替代品[4,29]。

Boens等人[30]合成的BODIPY染料（13-15）有苯酚或萘酚基团作为H 受体部分，其pK_a值为7.5-9.3。所述染料的最大吸收峰在570-580nm区域而其荧光发射在大约610-620nm。它在监测细胞pH方面可作为有前途的荧光探针。

Tian等人[31] 通过快速的PET工艺形成了两个“荧光团间隔受体”pH染料体系。研究了在不同溶剂中的吸收和荧光性能。该染料是适用于水溶液的荧光pH探针，探

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