英语原文共 8 页，剩余内容已隐藏，支付完成后下载完整资料

用于荧光检测乳酸脱氢酶的“Turn-On”型的静电纺丝量子点/聚合物复合多孔纤维

Xiaolong He, Longfei Tan, Xiaoli Wu , Chuanmiao Yan , Dong Chen , Xianwei Meng and Fangqiong Tang. Journal of Materials Chemistry, 2012, 22, 18471

摘要

通过简单的静电纺丝法制备一种基于CdSe QDs/聚己内酯（PCL）复合多孔纤维的新型酶传感器。我们选择生物相容性聚合物—聚己内酯作为静电纺丝纤维的基体聚合物，制备CdSe QDs作为传感探针。实验结果表明CdSe QDs可混溶在含有N，N-二甲基甲酰胺、氯仿的静电纺丝溶液中，并且对PCL具有化学惰性。由于CdSe QDs均匀分布在PCL纤维内部，因此保留了原有的荧光性能。此外，成孔剂产生的纤维二次孔结构促进分析物扩散和提高灵敏度。由于NAD和CdSe QDs之间电子转移过程，通过NAD可实现荧光纤维的可逆淬灭。基于纤维形成的薄膜和NAD还原成NADH酶催化反应，该传感器已成功地实现了荧光“turn-on”检测的NAD-依赖性酶，乳酸脱氢酶（LDH）。每个样品的检测时间只有十分钟，从200 –24 00 mu;L^-1得到LDH活性的线性校准曲线。这些量子点复合多孔纤维可作为一种简便、快速、灵敏、稳定的NAD依赖性酶检测平台，也能应用在新型光学器件中。

1 前言

酶活性的检测广泛应用于临床诊断各种人类疾病^1-4。乳酸脱氢酶（LDH）（其可催化L- 乳酸和丙酮酸的相互转换）几乎存在于人体内的所有的器官。一些生理疾病，组织中的细胞的环境中的LDH水平将高于正常人，如溶血性贫血，充血性心脏疾病和肝炎，尤其是肝癌。因此检测LDH活性对这些疾病的早期诊断和术后监测具有重要意义^5-7。许多技术已经开发用于LDH活性的分析，例如酶联免疫吸附测定（ELISA）、比色、荧光或安培检测^8-10。这些分析方法中，由于其荧光尺寸可控、高荧光量子产率、广泛吸收、窄发射光谱和对光漂白的稳定性，基于量子点的荧光分析已成为快速、灵敏的检测酶活性技术^11-14。然而，量子点与生物分子的复杂功能化和量子点在检测溶液中易聚集，目前在均相中基于QD的研究受到其重复性差和低的稳定性的限制^15,16。因此，开发基于量子点的轻便、高度稳定、超灵敏的光学传感器势在必行。

现今静电纺丝已被发现是一种通用、有效的技术来制造具有大表面面积纤维膜，其三维多孔结构^17-20用于快速且灵敏的传感应用的。通过引入传感探头或分子识别位点，静电纺丝纳米纤维已经开发了各种荧光传感器，如金属离子传感器、气体传感器和pH传感器^21-25。近年来，经过不断地努力将量子点引入静电纺丝膜的新型光学传感器，具有良好再现性，优良的光化学稳定性和高灵敏度等优点^26,27。李等人已经证实静电纺丝能将量子点很好的分散在聚乙烯醇纳米纤维中，并且量子点之间的荧光共振能量转移（FRET）被有效避免，量子点的荧光特性不受影响²⁸。Meng等已经合成了CdSe/ ZnS核-壳量子点/聚苯乙烯电纺纤维，它具有响应速度快，灵敏度高，优秀的可逆性和湿度敏感的长期稳定性的特点²⁹。然而，据我们所知，没有基于量子点复合电纺纤维制造生物传感器的报道。

在本工作中，首次提出基于QD复合聚合物电纺纤维的新型的酶传感器的研究。我们选择聚己内酯（PCL）作为电纺纤维的主体聚合物，制备的CdSe量子点作为传感器的传感探针。由于静电纺丝过程中溶剂的挥发速度很快，硒化镉量子点被均匀地分布在PCL纤维中，并且具有很强的荧光效应。为了加速内纤维分析物扩散和提高灵敏度，通过成孔剂产生纤维的二次孔结构。此外，我们发现由于NAD和CdSe QDs之间发生电子转移过程，通过NAD可实现荧光纤维的可逆淬灭。基于纤维形成的薄膜和酶催化的反应，该传感器成功实现了荧光导通检测的NAD依赖性酶，乳酸脱氢酶（LDH）。与荧光淬灭传感器相比，开启荧光酶传感器可有效降低背景信号，避免其他错误淬灭信号造成干扰，最终增强传感器的灵敏度和选择性 ^30-33。量子点/聚合物复合材料荧光多孔电纺纤维应用于传感研究，可以作为分析众多酶的简便，快速，灵敏，稳定的平台。

2 实验

2.1 化学药品和试剂

氧化镉（99.99％），硒（99.5％，100目），油酸（OA，90％），N，N-二甲基甲酰胺（DMF），氯仿（国药集团化学试剂有限公司北京购），三辛基氧化膦（TOPO，90％），三辛基（TOP，97％），1-十八烯（ODE），油基胺（OLA，70％），聚己内酯（PCL，M_w=80000），L - 乳酸（LL），尿酸（UA），beta;-D-葡萄糖，D-半乳糖（DG）自Sigma-Aldrich购买的，乳酸脱氢酶（LDH，30U mg^-1），烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD），NADH购自上海Kayon生物科技公司，所有的化学品被用来无需进一步纯化。

2.2 油溶性CdSe量子点的合成

通过文献描述方法稍作改正之后制备了CdSe量子点³⁴。简言之，0.1 mmol CdO、0.5 mL OA、15 mL ODE 装入25 mL 的三颈烧瓶中，在氮气流下加热至260 ℃恒温2 h获得澄清溶液。将溶液冷却至室温，加入1 mL OLA 和 0.5 g TOPO。在氮气流下将混合物再加热到280 ℃至形成光学透明的溶液，将含有0.2 mmol Se，300 mL TOP和2 mL ODE的溶液迅速注入到反应烧瓶中。注射后，温度降至260 ℃以助于量子点生长，保持此温度约20分钟，获得的CdSe QDs。

在图1中显示的紫外吸收峰中可以看到，CdSe QDs的第一激子峰出现在580 nm处，其它吸收峰存在于400〜550 nm 之间。窄的第一激子峰表明，制备的硒化镉量子点结晶度高并单分散³⁵。荧光发射峰最大值出现在593 nm，半峰宽最大值约38 nm（图1）。CdSe QDs的透射电子显微镜（TEM）图像如图2所示，CdSe QDs有一个均一的分布。从TEM图像上分析了CdSe QDs的尺寸，并与明显的CdSe QDs 紫外-可见吸收峰进行计算核对结果数值³⁶,我们发现这两个值几乎相同，CdSe QDs的的平均尺寸为3.8plusmn;0.1 nm。

图1. CdSe QDs光学性能：明显得紫外-可见吸收峰和荧光发射峰

图2.CdSe QDs的TEM图像

2.3 CdSe QDs复合电纺荧光多孔纤维膜的制备

CdSe QDs复合电纺荧光多孔纤维膜的制备如下：为了将CdSe QDs 分散在纺丝溶液中必须将它们从反应混合物中分离，以除去过量的配位体和反应前体。将甲醇和氯仿加入到反应混合物中，并通过离心分离沉淀即可。最后CdSe QDs重新溶解在氯仿和DMF的混合溶剂（氯仿:DMF=6:1，体积比），CdSe QDs浓度为0.5 mM用于电纺。将PCL (15 wt%)通过整夜剧烈搅拌溶解在上述纺丝液中，得到混溶的CdSe QDs与PCL静电纺丝溶液。

为了制备纤维的二级多孔结构，向纺丝液中加入一定量的水溶性成孔剂TX-45，TX-45在纺丝溶液中具有很好的相溶性，所以TX-45添加与否不影响实验参数的调整。将制备好的静电纺丝溶液转移到注射器中，推进速度0.5 mL h^-1，注射器尖端和接地之间直流电压为15千伏，工作距离为15 cm，针头内径为0.9 mm。纤维收集在铟锡氧化物（ITO）涂层的玻璃板（0.8 cm * 2 cm）上，收集时间为6 min。所得到的纤维膜浸入水中12 h除去TX-45，然后在真空烘箱中室温干燥12 h除去水³⁷，纤维膜制备完成。

2.4仪器和表征

使用Cary Eclipse荧光分光光度计（Varian公司）进行荧光测试，纤维喷镀金使用 Hitachi S-4300进行SEM测试观察形态，JEM-2100电子显微镜在200 KV操作电压下得（TEM）图像，JASCO V-570分光光度计得到在室温下的紫外可见吸收光谱，Nikon-Ti (Japan)显微镜采集荧光图像。

2.5 荧光实验

固定激发波400 nm、扫描速率300 nm min^-1下得到复合薄膜的荧光光谱。激发和发射的槽宽度为5 nm，荧光信号被记录范围550-680 nm之间。该检测试验描述如下：为研究NAD的淬火效果，传感膜固定于ITO玻璃板的表面上，浸渍于2 mL不同浓度的NAD PBS缓冲液（pH=7.0）中，一定时间记录下传感膜的荧光强度。LDH活性的检测：一定量的NAD加入到2 ml的PBS缓冲液（pH=7.0）中，传感膜浸润5 min；然后加入等摩尔量的LL和不同量的LDH，5 min；最后收集数据分析。

3 结果与讨论

3.1静电纺丝量子点/聚合物复合多孔纤维膜的性能与表征

我们选择生物相容性聚合物—聚己内酯（PCL）作为静电纺丝纤维的主基体聚合物，制备的CdSe QDs作为传感探针。实验中我们发现，在含有N，N-二甲基甲酰胺、氯仿的静电纺丝溶剂中，CdSe QDs与PCL是混溶的，PCL化学混合入CdSe QDs中。如图3中，由PCL和QDs/PCL制成的电纺纤维，直径都约为2 mm并且均匀光滑。PCL和QDs/PCL电纺纤维的形态和直径无明显差异，表明加入的CdSe QDs不会影响到纤维的原始形态。使用TEM观察到CdSe QDs在纤维中的分布（图4），CdSe QDs均匀分布在PCL纤维中。通常在溶液共混中，随着溶剂的挥发，会导致相分离，并且纳米粒子团聚，但这里CdSe QDs在PCL电纺纤维均匀分布。这是因为在电纺丝过程中，溶剂快速挥发冻结PCL聚合物链，以及CdSe QDs仅限于初始的地方来不及团聚，从而使量子点原有的荧光特性不受影响。因此，通过静电纺丝制备了极其明亮的QDs/PCL纤维。QDs/PCL多孔纤维膜的荧光性能也在图5中显示，相比于CdSe QDs，所得纤维的荧光发射峰稍有改变，这也的表明了QDs均匀的分散在纤维中并且很好保留了荧光性能。

图3.（a) 和(b)PCL的SEM图像 （c)和 (d)QDs/PCL的SEM图像

图4. QDs/PCL的TEM图像

通过成孔剂TX-45产生纤维二次孔结构，以提高传感器的灵敏度。在静电纺丝之前，将一定量的TX-45加入到PCL和CdSe QDs的静电纺丝溶液中。TX-45是水溶性的，因此将制备的纤维膜在水中浸渍12 h后TX-45可完全溶解³⁷。采用SEM观察纤维的表面形态，无TX-45的PCL纤维的表面是光滑的（图 6a）。在水中浸泡除去成孔剂后，含TX-45纤维表面形成均匀的孔隙，即多孔纤维（图 6b）。

图5. PCL、PCL/QDs 标准荧光光谱

图6. (a)PCL纤维的SEM 、(b)TX-45:PCL =1：2的多孔纤维SEM图

最近的论文报道，电子转移（ET）过程可以在NAD和NAD官能化亲水核-壳 CdSe/ZnSe QDs之间发生，并且量子点的荧光会被淬灭^38,39。在我们的研究中发现，我们的制备的CdSe QDs复合荧光多孔纤维可以与溶液中的NAD分子直接可逆地淬灭。在我们的体系（方案1）中，NAD分子扩散到CdSe QDs的表面，并影响QDs表面的化学键。NAD作为一个良好的电子受体（蓝色部分）立即捕获光激发的CdSe QDs的电子，在QDs和NAD之间发生ET过程。因此静电荧光多孔性纤维膜的荧光被淬灭。

图7. TX-45:PCL =1：2多孔纤维(a)浸泡在NAD (10

mM) PBS 缓冲液前和(b) 浸泡后的荧光显微镜图像

通过荧光显微镜观察荧光多孔纤维浸泡在 NAD (10 mM) PBS 溶液后的荧光效果（图7）。在量子点/PCL复合薄膜的荧光显微镜图表面明亮的CdSe QDs均匀分布在纤维内部，这与TEM图像一致。在 NAD PBS缓冲液中浸泡10 min，纤维膜的荧光完全猝灭。

一系列的NAD溶液（5 mM）作为猝灭剂来研究次生孔隙对淬灭敏感性的影响， TX-45 ：PCL的质量比分别为0：1，1：3，1：2，1：1。根据图8所示的荧光淬灭数据显示，传感膜的淬灭速率随TX-45与PCL的比率的增加而增加。TX-45：PCL=1：2的与没有二次孔结构的纤维膜比较，淬灭速率增加了5.2倍；TX-45：PCL=1：2与TX-45：PCL=1：1相比，淬灭速率几乎相同；当TX-45：PCL=1：1时，纤维被破坏。因此在以下实验中，选1：2作为最佳比例制备多孔纤维膜以检测LDH活性。引入TX-45和随后的去除，荧光纤维变得更加多孔，有利于NAD分子的内部纤维的扩散。因此，在NAD和 QDs之间的接触、碰撞和相互作用显著增加，从而导致传感器的灵敏度显著增加。

Scheme 1 基于 CdSe QD 渗入荧光多孔纤维膜和酶催化反应的LDH酶活性检测 (a)开启检测过程示意图 (b) 薄膜的荧光照片 (c) NAD 和NADH的结构式.

图8. 荧光多孔纤维膜浸在NAD PBS (5 mM)溶液中0-5min的荧光光谱 (a, b) TX-45：PCL =0 : 1；

剩余内容已隐藏，支付完成后下载完整资料

资料编号：[151492]，资料为PDF文档或Word文档，PDF文档可免费转换为Word