空间控制水凝胶力学调控干细胞的相互作用外文翻译资料

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空间控制水凝胶力学调控干细胞的相互作用

Ross A. Marklein and Jason A. Burdick*

Received 17th August 2009, Accepted 29th September 2009

First published as an Advance Article on the web 27th October 2009

DOI: 10.1039/b916933d

生物材料设计中，局部控制干细胞的微环境对组织工程至关重要。近年来，由于力学性能在干细胞增殖、细胞形态和分化上的影响，在生物材料设计中基质的力学性能受到格外地关注。为了研究力学性能的局部控制对人间充质干细胞（hMSCs）的影响，我们创造了一种有序交联的透明质酸水凝胶系统，它能形成力学性能（不同的模型和梯度）不同的空间模型。合成的酰基化的透明质酸通过二硫键的Micheal加成和光激发的聚合反应形成交联。通过控制交联过程中甲基丙烯酸甲酯的初始含量、限制UV照射区域和控制UV照射时间，我们可以在一个很大的范围内（约3kPa～100kPa）获得力学性能统一的水凝胶模型。hMSCs在较硬的水凝胶中的伸展和增殖相较于在较软的水凝胶中培养的细胞都有所增加。此外，细胞在力学性能模型水凝胶中的伸展和增殖行为与局部的力学性能呈现相关性。这种方法通过空间控制基质的力学性能调节干细胞生长的微环境的新型水凝胶系统。

前言

目前，研究干细胞在天然组织和人工系统中与微环境的相互作用以及对环境的反应。例如，在最初的体细胞研究中，包括成纤维细胞、内皮细胞，以及最近在干细胞的研究中，很明显细胞对周围环境机械性能的不同具有反应，甚至对特定的细胞谱系都有影响。天然组织的硬度各不相同（例如：脑组织 0.1-1kPa，松弛的肌肉～10kPa，预矿化骨gt;30kPa），干细胞在以上的条件下会分化成特定组织的细胞谱系。因此，弄清楚细胞的这种行为，对我们在组织工程应用中生物材料的设计很有帮助，更容易理解在疾病状态下的细胞行为。例如，在力学性质强于健康组织的受伤后的心肌成纤维层中的干细胞可能有分化行为，并且矿化其周围的基质成分。

组织工程策略是通过整合基质的机械性能的一种方法控制干细胞行为，包括细胞形态、细胞增殖和分泌细胞外基质(ECM)等细胞行为。再与其他分化因素，例如生长因子、黏附位点，在组织修复与再生工程过程中，利用仿生学调控固有的力学性能。然而，目前在这些研究中使用的生物系统有一个限制，就是无法控制支架的空间网络性能。由于组织的异构性质，就必须反映基质在空间和时间属性上的这些差异，以便针对适当的细胞行为和组织一体化进行支架设计。局部力学性能中的空间差异也与某些病症和伤口愈合过程相关，因此，表征和理解这些复杂的微环境对细胞的基本影响，能帮助我们更好地理解干细胞行为，也是发展有效的组织工程战略的关键环节。
只有几个例子中存在在空间上进行调控水凝胶性质。因为光线能提供精确的控制，很大程度上是依赖于控制光照条件来调控水凝胶特性。光聚合用UV光是一个通常使用的技术，其涉及自由基聚合丙烯酸或丙烯酸酯官能化聚合物。通过这种将光线限制在某些区域，曝光的复杂模块和未曝光区域可以在空间上赋予水凝胶不同的特性来控制细胞行为。除了模块化，在许多应用会用到梯度变化，并在许多组织中发现梯度变化，并且可以直接影响细胞迁移。水凝胶的梯度变化可以使用特定的混合装置或微流体腔室来形成，但这些技术依赖于使用复杂的系统或只有某些梯度范围。因此，需要一种可在空间上进行调控机械性能水凝胶系统。
透明质酸（HA）是一种多糖，它存在于天然组织，并且也密切参与如伤口愈合，细胞迁移，胚胎发生和炎症反应。HA可以得到可调支架性质广泛的分子量，在主链上也存在化学改性基团（羟基和羧基）。官能化的HA中的反应基团如甲基丙烯酸酯和丙烯酸酯已被用于形成控制干细胞分化的HA水凝胶。这些系统具有均匀的凝胶特性，能进行有效的细胞封装，但没有在空间和时间上局部调控网络的特性。最近，基于丙烯酸酯化HA的水凝胶系统通过利用包括在改性的HA主链的丙烯酸酯官能组的两步交联演示调控空间特性影响人类间质干细胞（hMSCs）的细胞行为。这两种交联的差别在于：UV光进一步曝光的区域和仅在初始步骤中曝光交联区域。这些模块的3D环境中只表现出力学性能的细微变化，比较hMSCs在双联区域的圆形形态与单交联区域的扩增形态。
在目前的研究中，利用在力学上的大范围变化（从几个千帕至100千帕）类似的双重交联的方法来探讨2D的hMSC的行为，即扩散和扩散力学的影响。此外，机械的空间模块，通过在第二次交联过程中区域限制光线照射实现。模块和梯度变化，控制hMSCs的行为的特性也进行了研究。尽管这仅仅是向这些系统只是组织工程中实际支架构建的初步步骤，但是这种新型的系统通过调控基质空间力学性质来引导干细胞行为。

实验

甲基丙烯酸酯化的透明质酸（MeHA）合成
按照之前的方法，MeHA已被成功合成。简而言之，按照1%的比例，将透明质酸钠（Lifecore，59 kDa）溶于去离子水，并将甲基丙烯酸酐（MA）是在4℃下逐滴滴加的。通过加入5N的氢氧化钠，使pH在8小时内保持在8以上，随后过夜反应，进一步加入的MA（每克HA 1.2毫升MA），并在第二天保持pH 4小时。大分子单体溶液用去离子水透析3天，于-80℃下冷冻，冻干，并以粉末形式冷冻储存。¹H NMR在HA支架显示100％羟基化，从而导致如图中所示的的MeHA结构。图1A。
甲基丙烯酸幻灯片准备
为了方便地处理和加工薄凝胶，载玻片也是甲基丙烯酸化的，以许凝胶玻璃的共价连接。22毫米times;22毫米盖玻片第一等离子体涂覆3分钟以活化表面用于附着。接着，将100ul的3-（三甲氧基甲硅烷基）丙基甲基丙烯酸酯（Sigma）置于每个活化的载玻片上，并在100℃下反应1小时，随后110℃下处理10分钟。最后，载片用去离子水和乙醇冲洗，并使其干燥。
MeHA水凝胶的交联
MeHA水凝胶是用一个或两个步骤的交联过程（图1A）形成的。在第一步骤中，迈克尔型“加成反应”的交联是通过向3%的MeHA中引入二硫苏糖醇（DTT，Sigma公司），在BS缓冲液中引进，含有0.2M三乙醇胺（TEA，Sigma）和0.05％的I2959（Irgacure）。早先加入的各种量的DTT以改变甲基丙烯酸酯的理论摩尔量（12，15，20，30，50，和100％），在这第一步骤中，实现了一系列的初始力学。提前将寡肽GCGYGRGDSPG物加入DTT的交联步骤，允许行之有效的RGD结构粘连耦合形成​​网络联接。在载玻片之间形成150毫米间距的凝胶，和甲基丙烯酸酯化的载玻片用在一侧上以允许共价凝胶附着。混合后，溶液在37℃反应1小时，以完成“加法”交联步骤（-UV凝胶）。
图1：（A）甲基丙烯酸酯化的透明质酸（MeHA）和双交联机制的化学结构。甲基丙烯酸酯与DTT（二硫交联剂）的迈克尔加成反应，诱导pH为10的MeHA与TEA的溶液中的部分交联。在光引发剂的存在下暴露于UV光（虚线是动力学链），剩余的甲基丙烯酸酯被聚合以增加交联密度（即，力学）。

（B）在水凝胶力学的空间变化可以通过限制UV光来确定加成反应凝胶的区域，

使用光掩模来创建模型（左）或（经由滑动掩模）改变紫外线照射的时间来创建梯度（右）。
凝胶可进一步暴露于UV光以启动剩余未消耗的甲基丙烯酸酯的自由基交联。较准10 Mw/cm²，365纳米紫外光（Omnicure S1000 UV点光源固化系统，EXFO生命科学部，密西沙加，加拿大安大略省）用来均匀曝光整个凝胶4分钟（ UV凝胶）。通过（a）使用光掩模限制紫外光或（b）使用滑动光掩模改变光照时间，此步骤可以被执行以创建均匀的凝胶或创建具有空间控制力学（图1）。对于图案，光掩模是由多个包含500毫米条纹图案的打印透明胶片组成，图案是使用图像处理软件在20000dpi的分辨率下打印。以恒定线速度（10mm/min，用注射泵）经过一个在凝胶表面的光掩模来创建一系列不同的曝光时间，穿过15mm的距离交联（0-90s)，从而形成梯度凝胶。
水凝胶力学特性

水凝胶表面结构用原子力显微镜（AFM，维克生物镜I）量化。一个带有0.06N m^-1弹簧的硅珠AFM针头被用来得到保安凝胶上每个单独点的力学曲线(每个条件选取15个点)，其弹性模量已被计算出来。对于有图案的凝胶，沿着凝胶的长度
细胞种植
hMSCs从Lonza Corpration（Wakersville，MD）获得，并在所有的研究（通道2-5）采用低通道使用。在标准间充质干细胞培养基（a-MEM，10％胎牛血清（FBS），1％L-谷氨酰胺和培养用青霉素 - 链霉素）中进行细胞扩增和培养，以每平方厘米5000细胞的密度种植细胞。对于大多数的研究，1mM的RGD浓度是用来促进hMSC粘附和蔓延。为了确定较少的交联凝胶的溶胀（最低力学）是否会导致RGD配体的一种有效稀释，我们测试了几种配体密度（1，2，和5mM），以阐明配​​体密度对于细胞扩散的影响。在细胞接种之前，将凝胶放于之前的PBS中，在杀菌灯之下灭菌2h。
细胞成像和定量
使用倒置显微镜（Axiovert 200，Carl Zeiss Inc。），于24小时后计算均匀凝胶与图案凝胶的细胞传播区域。使用图像处理软件（NIH）计算每个条件下均匀凝胶（ - / UV）的平均细胞扩散面积（gt;每组50个细胞），同时也对条纹凝胶和梯度凝胶的区域做相同计算。用钙黄绿素AM（Invitrogen）染色细胞，在照片图案凝胶上成像。可通过将细胞与4%的福尔马林混合，然后使用0.25%v/v的Triton-X（Sigma）通透，使用2ug ml^-1的DAPI（Invitrogen）染色细胞核。将第1，第4和第7天每次拍得的5张图片放大10倍，技术细胞核，从而量化均匀凝胶组中的细胞增殖。
统计分析

实验数据处理为平均值和标准偏差（机械，增殖）或平均值的标准误差（细胞扩散）。用Student t-test（JMP软件）来比较-/ UV凝胶的力学测定、细胞扩散或细胞增殖，确定统计学差异（p lt;0.05）。
结果与讨论
MeHA水凝胶的特性和细胞反应
具有均匀力学水凝胶是由一个多步骤的交联过程形成的，其中加成反应交联（通过DTT）的最先进行（-UV组），以消耗所有的或小部分的反应性基团，然后接着通过自由基交联（ UV组），以进一步消耗反应性基团。在这种情况下，反应性取决于在HA上的甲基丙烯酸酯，可通过加成反应与硫醇（DTT上的）反应或在光与光引发剂存在的条件下形成动力学链的过程中彼此自由基聚合。以一个均匀的浓度（3%），高度官能化的HA（100％经修饰）可被用于允许大型力学变化;然而，这些参数可以调整，以改变整个凝胶性质。值得注意的是，在第二步骤使用了可在空间上被控制，以获得具有在不同区域性能的光。
AFM机械测试可定位探讨表面力学特这，这是代表了当细胞进行物质交换是会感受到什么。图2A示出了力学宽广的范围（近三个数量级），通过使用这种双重交联系统来实现。通过增加DTT的摩尔比改变初始丙烯酸消耗，水凝胶模量范围是从2.3千帕（12％DTT UV）到84千帕（100％DTT UV）。另外，这些凝胶被UV光照射导致至1在所有的双交联的水凝胶中有至多100千帕的增加模量，这与仅使用自由基交联步骤（图2A，0％DTT UV）聚合的水凝胶吻合。除去100％ - / UV凝胶，有在所有情况下-/ UV凝胶之间的力学差异显著（** P lt;0.001）。
依次交联水凝胶的能力已经被用于一个类似加成反应-自由基依次交联体系和在含多组分互穿网络的其他体系中，多组分互穿网络中两个网络通过不同的方式交联。然而，这些系统中没有一个表现出的力学范围能与使用这种双重交联的MeHA系统实现的力学相比。虽然多组分水凝胶系统允许多个细胞识别位点的结合与力学和退化上的时空控制，这些微环境的复杂性使得确定影响干细胞行为的因素变得更加困难。在我们的系统中，我们使用一个恒定的聚合物和配体的浓度，而只改变相同大分子的交联，因此机械是唯一因素。因此，hMSC的行为有任何观察到的差异应该归因于机械和配体密度和基质成分，而不是区域差异。
图2B显示的是hMSCs在水凝胶上的扩散区，这种水凝胶中一系列的DTT在24h后被消耗制备-/ UV水凝胶。再次，除了100％- / UV凝胶（那里在力学上没有一个显著变化），在所有- / UV凝胶上培养的细胞两者之间具有显著差异。细胞扩增区域在图2C中也被绘制为水凝胶力学的函数。这表明从扩增区域增加到停滞期间，hMSC传播培养对于力学结构的一个明确依赖。也在使用其它基质和其它细胞类型的研究中发现，增加力学时细胞区域增加。干细胞扩增发展的能力，与整合素结合和细胞骨架整合到这些粘附网上相关，它负责细胞张力的发展，对于粘附从属细胞刚度依赖。RGD图案的存在允许它与alpha;1beta;5整合蛋白相结合，整合蛋白参与干细胞形态和功能的决定，

RGD的重要性进一步体现在可形成无耦合RGD的HA凝胶的阴性对照，这表明没有细胞传播发生在软的与硬的基质中。（未给出数据）。

12％DTT -/ UV凝胶的柱状图分析显示出在传播区域方面具有。两组不同的hMSCs数量（图3）。软的12%-UV凝胶上的细胞传播很少且会显示球形外貌，而硬的 UV凝胶则显示多形态传播与广泛分布。插入图片显示的是在各个条件24h后的细胞。这些传播形态的不同（由于力学特性）可进一步指定谱系，因为干细胞以显示可通过多种不同的反应去控制和限制细胞形态，当它们在一个恒

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