FGF-2与TGF-β1协同促进生物打印人均一性新生软骨形成外文翻译资料

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FGF-2与TGF-beta;1协同促进生物打印人均一性新生软骨形成

摘要：生物打印在软骨组织工程中是一种极具前景但还未彻底研究的方法，具有高通量、数字控制、细胞准确定位、以及生物支架材料与靶位点同时聚合等优点。本研究测试了生物打印在软骨组织工程中应用的可行性，检测了细胞密度、分化因子对增殖的影响。人的关节软骨细胞以不同的密度打印，经过生长因子的短暂刺激后，使用软骨形成因子进行刺激。样品培养四周后，对细胞的增殖和活力、力学性能、质量溶胀比、水含量、基因表达、ECM产量、DNA含量以及组织学检测进行评价。结果表明，经过FGF-2/ TGF-beta;1处理的样品具有最佳的软骨形成特性。低细胞密度组中每个细胞的ECM产量高于高细胞密度组。以上结果经力学性能测试、组织学检测也同样被证实。综上所述，当使用合适的生长、分化因子时，对于人关节软骨的形成，在生物打印上也会有一个最佳的细胞种植密度。

关键词：喷墨式打印；软骨组织工程；软骨细胞；水凝胶；细胞外基质；光聚合

前言

基于热喷墨打印技术的生物打印于2003年被提出用于生物制造，具有高通量、数字控制、在二维/三维中高度准确的细胞、生物因子、支架材料定位等优点（Wilson and Boland, 2003）。此技术已有很多成功的前例（Boland et al., 2006; Cui and Boland, 2009; Xu et al., 2006）。在本研究中，我们基于改进的Hewlett-Packard (HP) Deskjet 500热喷墨式打印机开发了一个3D生物打印平台，同时配合使用聚乙二醇（PEG）聚合形成的水凝胶用于软骨组织工程。PEG水凝胶被证实具有保持软骨细胞活性以及诱导软骨形成细胞外基质的能力（Bryant and Anseth, 2002; Elisseeff et al., 2000）。PEG的物理和力学性能可以通过调节来匹配人的关节软骨性能（Bryant et al., 2004）。此外，PEG是水溶性的、低粘度、修饰后能够用于光聚合，因此能够在3D打印过程中同时完成聚合反应。在本研究中，含有人软骨细胞的聚乙烯乙二醇二甲基丙烯酸酯（PEGDMA; MW, 3400）和光引发剂被准确放置，以层层自组装的方式构建软骨组织。打印时，生物喷出的体积为130pL/滴，分辨率为300dpi（85mu;m）（Buskirk et al., 1988; Harmon and Widder, 1988）。人软骨细胞通过层层自组装并同时完成聚合的方式在3D水凝胶中实现了平均而又准确的分配，以此形成的软骨具有更好的力学性能和更高的ECM产量。相较而言，手工或者打印后聚合构建的结构体，由于重力的原因，软骨细胞就会聚集在结构体的底部而不是最开始被放置的位置，其结果就是形成不均一性的软骨（Cuiet al., 2012）虽然生物打印基于以上研究促进了软骨工程的发展，但是有研究表明在软骨组织工程中，当使用牛软骨细胞（Sharma et al., 2007）和间充质干细胞（MSCs; Buxton et al., 2011）时，细胞种植密度为10-20times;10⁶cells/mL才能获得较高的ECM产量。然而，为了保证最佳的打印分辨率，生物墨中的最大细胞浓度为8times;10⁶cells/mL（Cui et al., 2010）。这些发现表明在软骨组织工程中使用生物打印的方法，最佳的细胞密度无法实现。但是，生长、分化因子在不同的打印浓度中的影响还未被研究。

胰岛素-铁传递蛋白-硒（ITS ）基础培养基，含10ng/mL TGF-beta;1，能够在3D培养中维持软骨细胞表型（Grogan et al., 2006）。虽然TGF-beta;1补充培养基对于维持软骨形成过程中ECM蛋白的表达似乎是充足的，但是不能有效促进软骨细胞的增殖与扩增（Yaeger et al., 1997）。成纤维细胞生长因子-2（FGF-2）补充培养基被证实能够有效促进软骨细胞单层增殖和软骨形成（Jakob et al., 2001; Mandl et al., 2002, 2004）。在本研究中，我们第一次检测了在生物打印的包含细胞的3D水凝胶中这些生长因子在软骨细胞增殖过程中所扮演的角色以及ECM产量。我们的猜想是在生物打印软骨组织工程中，使用合适的生长因子进行刺激，能够诱导软骨细胞增殖，提高ECM产量，同时保证高的打印分辨率。处理后的低细胞密度生物打印结构体将接近或匹配工程软骨的功能特性。

材料和方法

材料

Dulbeccorsquo;s modified Eaglersquo;s medium (DMEM) was obtained from Mediatech (Manassas, VA).

LIVE/DEAD1 Viability/Cytotoxicity kit was purchased from Invitrogen(Carlsbad, CA).

Human serum albumin was obtained from Bayer (Elkhart, IN).

TGF-b1 and FGF-2 were purchased from PeproTech Inc. (Rocky Hill, NJ).

Photoinitiator Irgacure 2959 (I-2959) was purchased from Ciba Specialty Chemicals (Tarrytown, NY).

Primers were from Applied Biosystems (Carlsbad, CA).

All other chemicals were obtained from Sigma–Aldrich (St. Louis, MO) unless otherwise noted.

PEGDA制备

PEGDA按先前描述的方法制备（Lin- Gibson et al., 2004）。简言之，PEG（3kDa）溶解于四氢呋喃中，在氮气氛围以及二乙胺存在条件下，与丙烯酰氯反应过夜。经乙醚沉淀后，即得到纯化的PEGDA，冻干过夜。质子核磁共振（¹H NMR）检测表明酰基化率为95%。

人软骨细胞分离

健康的关节软骨由成人供体提供（meanplusmn;SD age 26.8plusmn;6.7），来源于组织银行，且无关节疾病史。关节软骨和软骨细胞从死亡时间在72小时内的尸体上分离获得（Blanco et al., 1995; Maier et al., 1993）。简言之，收集得到软骨样品后，剪碎后于0.5mg/mL胰蛋白酶中37℃消化15min。然后去除胰蛋白酶，于含2mg/mLⅣ型梭菌胶原酶、5%胎牛血清的DMEM中37℃消化12-16h。

用1times;青霉素-链霉素-谷氨酰胺（PSG; Invitrogen）补充的DMEM洗涤释放出的人软骨细胞三次，细胞活力大于95%。分离的软骨细胞接种于T175组织培养瓶进行单层扩增培养，接种量为每瓶5百万个细胞，培养基为含10%小牛血清、1times;PSG的DMEM。细胞在37℃、湿润空气、5%CO₂条件下培养。培养基每四天更换一次。当细胞达到80-90%融合度时开始使用（原代培养1-2周）。本研究中用到的所有细胞均为第一代细胞。

生物墨制备

取PEGDMA，溶解于PBS中，终浓度为10%质量/体积（w/v）。光聚合物I-2959以0.05%w/v添加。人的关节软骨细胞悬浮于无菌的PEGDMA溶液中，密度为8times;10⁶cells/mL。

生物打印与细胞培养

生物打印平台按先前描述放置（Cui and Boland, 2009）。打印机在紫外线下照射至少2小时除菌。HP Deskjet pens with 50 firing chambers先用70%乙醇冲洗三次，随后用无菌水冲洗干净。一个长波紫外线灯（Model B-100AP, UVP, Upland, CA）放置于打印平台上方25cm处，用于在打印的同时完成光聚合。平台上的紫外线强度为4-8mW/cm²。打印笔充满生物墨水，并用锡箔纸包住，避免细胞受到紫外线损伤。直径为4mm的圆柱形模具作为生物打印纸，与打印头的距离为1-2mm。使用Adobe Photoshop (Adobe Systems, San Jose, CA)设计目标模型及尺寸，通过层层打印构建3D结构体（Fig. 1A）。ITS 培养基包含1times;胰岛素-铁传递蛋白-硒（ITS ）、0.1mM维生素C磷酸酯、1.25mg/mL人血清白蛋白、10^-7M地塞米松、1times;PSG的DMEM。10ng/mLFGF-2或FGF-2/ TGF-beta;1补充的ITS 在培养的第一周使用，用于细胞的扩增。随后的2-4周使用10ng/mL TGF-beta;1补充的ITS 培养基，该培养基为标准软骨形成培养基（Schmitt et al., 2003）。含有细胞的水凝胶使用标准软骨形成培养基培养1-4周作为对照。高细胞密度水凝胶（20times;10⁶cells/mL）使用标准软骨形成培养基培养1-4周作为参考。每三天换一次培养基。打印后和培养过程中使用Live/Dead Viability/ Cytotoxicity 测定细胞活力。使用Zeiss LSM 510 laser scanning microscope (Carl Zeiss, Minneapolis, MN)对水凝胶结构体进行成像分析。

打印的PEGDMA水凝胶的力学性能

室温下使用一个定制的含有50g细胞的机电测试系统(LSB200, Futek, Irvine, CA)和双轴控制（LAC-25, SMAC, Carlsbad, CA）测定水凝胶的压缩模量。水凝胶样品放置于平行的平台上，使用轴控制器测定其厚度。采用分段依次加压的方式对水凝胶进行负载，经过四次渐进应变加载，速度为0.1mm/s，达到20%应变的最大值。每次加载后经过一个释放阶段回到平衡。无约束的压缩模量根据释放阶段最后的荷载和位移计算得到（Hoenig et al., 2011）。平行测定三次。

打印的PEGDMA水凝胶溶胀研究

37℃下，将PEGDMA置于培养基中48小时，以达到溶胀平衡，测定得到平衡溶胀质量。冻干48小时后称量得到其干重。水凝胶的平衡质量溶胀比（Q）和水含量（M）根据以下公式计算得到。

质量溶胀比

平衡水含量

其中，表示水凝胶溶胀后质量，表示水凝胶干重。

实时定量PCR分析基因表达

在培养过程中第一、二、三、四周分析水凝胶中细胞的基因表达（n=3）.样品放入液氮中冷冻后破碎，破碎后的粉末转移到离心管中，并加入适量RNA裂解缓冲液（QIAGEN, Valencia, CA），室温下消化15min。然后转移至离心管（QIAGEN）中，12000g离心2min，上清转移至spin 管中。按工具书说明对RNA进行纯化。使用紫外分光光度计Nanodrop ND-1000 (Thermo Scientific, Wilmington, DE)测定总RNA含量及纯度。使用高容量的cDNA反转录试剂盒（Applied Biosystems），将分离的总RNA经反转录得到cDNA。使用TaqMan基因表达检测探针(Applied Biosystems)，利用RT-PCR（LightCycler 480II Real-Time PCR System, Roche, Basel, Switzerland）检测人Ⅰ型胶原（COL1A1; Hs00164004_m1）、Ⅱ型胶原（COL2A1; Hs01064869_m1）、和甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH; Hs99999905_m1）表达相关的蛋白聚糖（ACAN; Hs00153936_m1）的基因表达。GAPDH视为看家基因。

生化检测

在不同的时间点，将样品冻干48小时后，用手术刀切成薄片，置于木瓜酶或胃蛋白酶中消化。每个样品使用1mL木瓜酶溶液（125mu;g/mLⅢ型木瓜酶（Worthington Biochemical, Lakewood, NJ）、10mM L-半胱氨酸、100mM磷酸缓冲液、10mMEDTA、pH6.4）于60℃下抽提16h得到总糖胺聚糖（GAG）。每个样品使用1mL胃蛋白酶溶液（含100mu;g/mL胃蛋白酶的0.05M醋酸）于4℃下消化6天得到Ⅱ型胶原酶。

使用CyQUANT 细胞增殖检测（Invitrogen）测定每个样品的DNA含量，TECAN Safire 2 酶标仪(Mannedorf, Switzerland)得出结果。总GAG含量通过dimethymethylene blue dye 测定法（Farndale et al., 1986）得到。ELISA法测定溶解的Ⅱ型胶原含量。每个样品的GAG、Ⅱ型胶原含量与DNA含量、干重的比值用以评估植入的人软骨细胞的生物合成活性以及总ECM产量。每个样品的DNA含量与干重的比值用以评估培养过程中的细胞增殖。样本大小为三。

组织学检测

根据标准组织学检测方法，将样品置于10%福尔马林中过夜，然后转移至1times;PBS中直至包埋入石蜡中，于6-mu;m交叉处用超薄切片机（Microm HM

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