利用土壤中分离产生的脲酶菌株的自发生物矿化过程去除重金属离子外文翻译资料

利用土壤中分离产生的脲酶菌株的自发生物矿化过程去除重金属离子

李萌a,b 陈晓辉a 郭洪仙a

a清华大学土木工程系，北京100084，中国

b北京工商大学，北京100048，中国

摘要

关键词：生物矿化诱导 碳酸盐沉淀 重金属 脲酶 微生物

某些微生物可与特定的物质结合，从而矿化形成沉淀，这就提供了一种处理无机重金属污染物的有效方法，其中也包括相对稳定的固相中的重金属。本实验通过微观实验研究了镍，铜，铅，钴，锌和镉六种主要造成土壤污染的重金属，并研究了抗菌菌株对六种重金属盐的生物矿化过程。抗菌菌株即脲酶菌株，从苗圃土壤中分离出来，研究表明这些脲酶细菌可通过自身酶反应自发水解相关有机物产生尿素，由于这种酶反应导致土壤pH增加、可溶性碳酸盐产生增加，使得土壤溶液中的可溶性重金属离子与可溶性碳酸盐结合形成沉淀矿化并最终转化为碳酸盐的几率增加，因此脲酶菌株可以通过此过程去除重金属离子。实验中选取的脲酶菌株具有较高的去除率，即其在48小时培养后重金属离子去除率在88％到99％的菌株。脲酶菌株沉淀矿化过程中，通过扫描电子显微镜和X射线衍射分析显示，当pH为8-9时，微生物吸引溶液中的重金属离子使其形成菱形、球形或针状结晶碳酸盐矿物沉积包膜在脲酶细菌周围，当其达到一定大小时即可发生沉淀矿化，从而达到去除重金属离子的目的。本研究也表明，从苗圃土壤中分离产生的脲酶菌株一定程度上可承受土壤或废水中的重金属毒性，即在一定浓度的重金属溶液或者固相环境中，亦可将可溶性重金属螯合成生物矿类物质，因此脲酶菌株在重金属生物修复中起重要作用。

1. 引言

大多数天然重金属(例如铜，镍，锌)在溶液或者固相环境中的离子浓度较低，因此不会引起太大的毒性，某些重金属还可以为生命系统提供必需的营养元素。工业革命以来，重金属通过工业废水、垃圾渗滤、矿山开采、化肥农药农用化学品肆意使用、废弃物和化石燃料的燃烧以及城市污水处理(Diels et al，2006)等方式，以离子或者固体的形态在自然环境中富集，重金属已经对环境造成了严重污染。由于重金属被释放到环境中后，其本身不会自发降解亦不会被降解，所以这些重金属很容易通过生物链传导方式在植物、动物或人类中的积累(Mulligan等，2001)。当前，传统治理方法包括化学沉淀、离子交换或离子吸附等，这些方法只适用于重金属污染的废水的处理，而且效率低、废时也不经济(Kapoor和Viraraghavan，1995; Matheickal et al。1997; Cheung and Gu，2007)。近年来，将化学与生物学科结合用于科学研究的趋势越来越盛，越来越多的科学家努力从生物领域探究高效绿色的处理方法。微生物诱导矿化沉淀是微生物自发过程，由于其绿色无污染、技术要求低、培养环境要求等优势已被广泛研究。与无机物离子间直接结合形成沉淀产生的矿物相比，微生物诱导沉淀矿化产生的矿物具有独特的尺寸、结晶度、同位素和微量元素组成等特定性质(Ivanov和Chu，2008)，这为矿物的原理和结构分析提供了依据。微生物诱导沉淀矿化的应用包括通过浸出生产仿生材料和生物修复、无机污染物的固相捕获或岩石和其他多孔介质裂缝中的堵塞胶结(Hoffman and Deccho，1999)等。已通过研究证明，微生物诱导矿化产生的碳酸盐沉淀(MICP)可通过地下水运动在地下捕获放射性核素和微量元素，这就为处理微量重金属污染物如锶(Sr)和钡(Ba)的提供了有效手段(Fujita et al，2000,2004; Warren et al，2001)。

目前，许多研究集中在脲酶的碳酸盐诱导沉淀过程(Le Metayer-Levrel等，1999; Murphy和Ginn，2000)。脲酶(尿素酰胺水解酶; EC3.5.1.5)在各种微生物中都很常见的，实验表明1mol的尿素在细胞内自发水解生成1mol的氨和1mol的碳酸根离子，氨进一步水解可产生1mol铵根离子和1mol氢氧根离子，铵根离子可与碳酸根离子发生强烈双水解可形成碳酸氢盐、氨和氢氧根离子，并在水中达到化学平衡，大量积累的氢氧根离子又可以使碳酸氢盐化学平衡移动从而导致碳酸根离子的增加，这种转移产生的碳酸根离子可以在废水或土壤中进一步沉淀重金属离子。

1. 材料和方法

2.1富集筛选

选取中国北京清华大学幼苗园土壤分离产生脲酶的细菌菌株。将样品菌株悬浮在无菌水中，加蒸馏水适当稀释，并铺在尿素测试琼脂平板(BBL，Becton Dickinson and Company，Sparks，MD。)上。 观察培养基的颜色变化，当其从黄色变为粉红色时，选取粉红色区域的菌群，并通过重复画线操作(划线法)进一步提高菌群纯度。

2.2菌株和培养基

巴斯德氏菌菌株(ATCC11859)来自美国典型培养物保藏中心。中华根瘤菌(AS.1.2690)来自中国通用微生物培养收集中心(Luo et al.，2001)。

所有菌株在NH₄ -YE培养基中培养，其主要成分组成如下：酵母提取物20g / L； (NH₄)₂ SO₄10g / L(Whiffin等人，2005)。所有的培养基都在121℃高压灭菌20分钟。所有菌株在30℃、200r/min环境下培养。

2.3光密度(OD₆₀₀)和脲酶活性的测定

在实验过程中，使用可见光分光光度仪在波长600nm处测量的培养细菌的光密度(OD₆₀₀)作为生物量浓度的指标。有钙离子存在的情况下，取样后立即测量尿素酶活性；在没有钙离子的情况下，通过电导法测定脲酶活性。由于脲酶反应涉及将非离子底物尿素水解成离子产物，这使在标准条件下电导率的测量值增加。具体测量方法如下：将1ml细菌悬浮液加入到9ml的1.11mmol尿素中，并在25℃温度下记录5分钟溶液中的相对电导率变化。尿素酶活性的一个单位定义为每分钟水解1mmol尿素的酶量。在可测量的活性范围内，我们发现1.11mmol尿素的测量值与水解酶菌活性相关(van Paassen等，2007)。

2.4 DNA提取，16S rRNA基因的PCR扩增，DNA测序和序列分析

由实验说明书(TianGen Co.，China)可知，通过基因组DNA纯化试剂提取总基因组DNA，以获得PCR的DNA模板，再将所得的DNA模板分别在95℃培养4分钟，94℃ 培养1分钟，50℃培养1分钟，72℃培养1分钟，72℃培养10分钟，并在这些条件下，分别用引物27F(5rsquo; -AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3rsquo;)和1492R(5rsquo;-GGTTACCTTGTTACGACTT-3rsquo;)通过PCR扩增产生16S rDNA。然后，将10mmlPCR产物加载到1.0％琼脂糖凝胶上，并在3％叔乙酸乙二酯-EDTA(TAE)凝胶上通过电泳分离，接着将所得16S rDNA用溴化乙锭染色，使用BINTA 2020D UV trans-照明和Gel-Peo分析仪软件对PCR产物进行纯化处理。纯化处理后的基因产物，克隆到pMD18-T载体中，并由TaKaRa生物科技有限公司(中国大连)进行测序。将所得16S rDNA序列与GenBank中使用的BLAST(http：//www.ncbi.nlm.nih.gob/blast)以获得的序列进行比较，将相似度大于97％的序列单独分为一个操作分类单位进行系统发育分析，并用Mega 4.1(http://www.megasoftware.net)构建(这里举例说明的核苷酸序列已经保存在GenBank ID JN393848-JN393851)。

2.5重金属沉淀实验

将纯化好的脲酶菌株转接到液体培养基中培养48h，离心后取上清液，取1ml培养液、1ml接种物、0.5ml尿素分别配制六份初始溶液，再分别加入0.5ml 2g / L的NiCl₂，CuCl₂，PbCl₂，CoCl₂，ZnCl₂或CdCl₂标准溶液，在保证实验各组相同初始条件的前提下，同时开始实验，实验在合适温度下培养48小时。 选择最高效菌为基准，分析各种重金属的沉积速率。

2.6通过ICP-AES测量Ni，Cu，Pb，Co，Zn和Cd

通过电感耦合等离子体原子发射光谱(ICP-AES)IRIS Intrepid II系列(Thermo Elemental Co.，USA)在水溶液中的含量测量含Ni，Cu，Pb，Co，Zn和Cd等离子溶液。

2.7环境扫描电子显微镜(ESEM)

使用环境扫描电子显微镜(ESEM)FEI Quanta 200对实验过程中产生的沉淀物的进行直接检查和元素分析，使用的设备电压为10至20kv。

2.8 X射线衍射(XRD)

对沉淀物进行X射线衍射(XRD)。即将材料手工研磨粉碎并安装在载玻片上，在D / max-IIIA DIFFRATOMETER(日本理化株式会社)上检查样品。使用ICDD数据库(JCPDS)鉴定结晶相。

2.9 耐酸性实验

实验用电导仪测量了一系列具有不同pH值、其他条件相同的沉积重金属溶液耐酸性。实验中设置pH为0.5〜5.5，pH值以0.5为单位梯度。实验首先将一滴pH 5.5的稀HCl溶液滴在沉积物上，用放大镜方法并仔细观察看与沉积物的反应2分钟后，是否出现气泡。如果没有气泡出现，可以得出结论，沉积的重金属可以在该pH下能抵抗HCl溶液的腐蚀。随后将HCl溶液的pH降低滴在相同的沉积物，直到在一定pH下产生气泡，沉积层的耐酸值为前一个pH值。

3结果与讨论

3.1分离和初始脲酶分析

筛选培养基用于筛选脲酶菌株，即选择培养基中出现粉红色区域。实验表明脲酶在琼脂上生长或用脲酶试验液生长时，从花圃土壤中分离的所有细菌菌落中约10％为阳性脲酶菌株。

将表现出大红色区域的高活性脲酶菌株转移到NH₄ -YE琼脂培养基中进行富集纯化，然后在用于脲酶分批生长的摇瓶中发酵，根据发酵情况评价菌株纯度，接着使用NH₄-YE培养基选择阳性菌株，最后测量脲酶菌株的生物量。本实验中，将活性最高的四株脲酶菌株分别命名为UR31，UR41，UR47，UR53。此外，本研究还检测了高活性脲酶菌株菌株：巴氏杀菌剂和T. Tumescens菌株的沉淀重金属的能力，并测试了这些菌株的生物量和脲酶活性(图1)，结果表明巴氏杀菌剂具有更高的生物活性和生物量。

3.2鉴定和测序细菌

通过16S rRNA对这四个分离株进行基因鉴定和测序分析。结果表明，它们彼此密切相关，并且均属于芽孢杆菌属和孢子菌群的培养细菌。 BLAST结果表明，该组最接近的亲属是Sporosarcina globispora(UR53)，Sporosarcina koreensis(UR47)，Sporosarcina sp，R-31323(UR31)和迟缓芽孢杆菌(UR41)。据此，我们队这四种菌株构建了一个系统发育(相邻接合)树，如图2所示。

3.3重金属溶液化学变化

在含有尿素的重金属溶液中引入菌株，培养48小时后，重金属的去除率高达88％〜99％。 UR47显示Cu和Pb的去除率最高，UR31显示Zn，Co的去除率最高，T. tumescens对于Ni和Cd的去除率最高(图3)。由于这些细菌具有相对独特的可沉淀离子，还被用于检查溶液中个别重金属离子是否存在。

在重金属沉淀的过程中，在前20分钟内pH增加到9，之后缓慢下降。溶液中重金属离子浓度在实验前2小时内下降尤为急剧，之后缓慢降低，并且其浓度在剩余时间内保持大致相同的浓度(图4)。据此可知，脲酶细菌会参与重金属沉淀矿化过程，其中某些离子还有发生化学变化，例如六价铬转化为三价铬(Cheung et al，2006; Cheung and Gu，2007; Han and Gu，2010)。

3.4沉淀物的ESEM和XRD分析

通过ESEM检查在反应容器中形成的固体样品。检测表明，每种重金属晶体都表现出不同的形态：细菌尿素分解过程中产生的沉淀物大致呈菱形、球形和针状，一般为10-50 mm。从图5(a，d)可以看出：Ni和Co的沉淀主要为菱形，约为10-40m m。图 5(b，f)中的Cu和Cd化合物，显示大多为球形，晶体的尺寸小于Ni或Co的晶体尺寸，球形颗粒的尺寸约为5埃10微米。Pb和Zn化合物如图5(c，e)所示，显示大多为针状，尺寸为20-50 m。而析出物的XRD分析表明其中存在碳酸锌、碳酸铜、碳酸铅、碳酸镉、碳酸镍和碳酸钴等矿物沉淀，另外，XRD分析中出现的斑块是由于细菌细胞内Cr离子的沉淀(Cheung et al，2006; Cheung and Gu，2007)。

3.5耐酸性检测

实验中每种重金属沉积产生的矿物的耐酸性几乎是不可微分的(补充材料表S1)。 它们的耐酸性均高于1.5，耐酸值几乎都为2.0。查表可知，酸雨在环境中的pH值是3.5-5.6，因此，沉积的重金属矿物在一定程度上可以抵抗酸雨的侵蚀。

4结论

实验室测试表明，重金属污染物如Ni，Cu，Pb，Co，Zn和Cd可以通过脲酶细菌诱导沉淀矿化从而分离。分离产生的矿物通过ESEM和XRD分析可知其结构及组成，并通过耐酸性实验证实产生的矿物是可以抵抗酸雨侵蚀，即可以通过自然积累从自然界中去除。当然，最重要的是，沉淀矿化过程中pH及重金属离子过程中浓度变化，可作为矿化沉淀程度分析的重

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