黑索金（RDX)和2,4,6-三硝基甲苯（TNT)对蠕虫赤子爱胜蚯蚓交互亚致死的转录组研究外文翻译资料

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黑索金（RDX)和2,4,6-三硝基甲苯（TNT)对蠕虫赤子爱胜蚯蚓交互亚致死的转录组研究

摘要：

背景：爆炸性化合物，例如TNT和RDX，是常共存在环境中的顽强污染物。蚯蚓是分子水平上重要的生态和生物学指标物种，为了了解TNT和RDX对蚯蚓的联合效应，我们把蚯蚓（赤子爱胜蚓）在TNT(50毫克/千克土壤）和RDX(30毫克/千克土壤）中单独或联合暴露28天，以运用4K-cDNA阵列的交织环设计微阵列实验来描述基因表达，并且测量致命性终点、生长终点和繁殖终点。

结果：TNT和RDX的亚致死剂量对蚯蚓的生存和生长无显著影响，但显著减少茧和亚成体的数量。该混合物表现出比它们单独作用时更明显的生殖毒性，表明两者之间有相加作用。与控对照组比较，我们在只用TNT处理的蚯蚓中鉴别出321种差异表达转录组，在只用RDX处理的蚯蚓中鉴别出32种，而在用二者混合处理的蚯蚓中只鉴别出6种。在329种差异表达转录组中，有294种出现在只用TNT处理的实验组，有24种共同出现在TNT实验组和RDX实验组，还有3种存在于所有实验组。混合暴露组中基因表达的减少效应显示RDX可能在基因表达层面与TNT有着敌对性的相互作用。基因表达与复制的不同结果，可能归因于采样时间、相关复制基因的缺失和缺失许多有关差异表达转录组的信息。在TNT或者RDX暴露蚯蚓中，一个与复制有潜在关联的基因（海胆粘连蛋白）显著低迷，这可能与繁殖力下降有关。

结论：TNT和RDX的亚致死剂量影响许多生物途径，从固有的免疫反应到卵子形成，从而繁殖减少却不影响生存和生长。在基因表达层面观察到的RDX和TNT混合物之间复杂的相互作用，需要进一步，包括研究基因表达动力学和赤子爱胜蚯蚓的繁殖活动。这些努力对理解RDX和TNT之间的相加复制毒性是必不可少的。

背景

RDX和TNT是重要火药成分，常发现共存环境[1,2]。大量研究表明，TNT和RDX对土壤无脊椎动物有很强的毒害作用[ 3 ]。然而，这两种化合物的毒理学作用方式十分不同。TNT对赤子爱胜蚓是致命的，半致死浓度LC50为120mg/kg soil[3]。然而RDX只是减少亚成体的数量，（半数效应剂量EC50=5mg/kg土壤^[4]），浓度达到756mg/kg soil也不会致命^[5]。与造成氧化应激的TNT相反^[6,7]，RDX作用于人类和动物的中枢神经系统引起痉挛^{[ 8 ]}并引发神经中毒症状，例如蚯蚓的僵化和共济失调^{[ 9 ]}。TNT的亚致死剂量影响神经系统，导致类似高铁血红蛋白症的血液紊乱，并弱化赤子爱胜蚯蚓的免疫^{[ 10 ]}。然而，RDX对蚯蚓的毒理机制和RDX与TNT之间对蚯蚓的相互作用仍有大部分不为人所知。

蚯蚓被亚里士多德描述为“大地的肠”并被用来作为土壤污染物的生物学指标^{[ 11 ]}。在本研究中，我们调查比较赤子爱胜蚓单独暴露在RDX和TNT中和暴露在两者的混合物之中的亚致死转录反应。我们测试了蚯蚓的生殖毒性并且测量了曝光和未曝光的蚯蚓的基因表达。我们假设暴露于RDX、TNT或这两种的混合物中蚯蚓会显示出具有毒素特异的基因表达谱。我们的目标有三，一是鉴别蚯蚓的基因是被TNT或RDX单独或组合基因的影响；二是通过比较它们的基因表达谱，监测TNT和RDX之间的相互作用；三是获得有关TNT和RDX混合物暴露的毒理学作用方式。

结果

我们将成年蚯蚓在TNT为50mg/kg 土壤的环境中，在RDX为30mg/kg土壤的环境中，在两者的混合物的环境中，分别暴露28天。TNT和RDX的浓度分别取到使百分之五十的蚯蚓的茧产量到达终点，即EC50。（L.S.Inouye,未发布数据）。我们所得的茧数量结果与这两种化合物的目标值是一致的（表一）。我们没有观察到死亡的和生长的统计上的显著效果。繁殖终点确定在第56天，并且我们记录了处理样本中茧数量和亚成体数量的显著减少。TNT和RDX的混合物抑制后代产生的效果强于TNT或RDX单独使用的效果（表1）。

我们在每个实验组的五个生物重复试验中检验基因表达。也即是，所有实验组均使用40个蚯蚓cDNA 微阵列和一个均衡交织回路设计，然后在每个实验组的五个重复试验样本中都检验一只蚯蚓的基因表达^[12](图1和Additional file1:Table s1)。蚯蚓的mRNA 样本中加入了两种Stratagene Alien mRNAs,以保证cDNA合成、标记和杂化的质量，同时监测获得差异表达基因的统计分析的过程和功率。虽然每一个cRNA和控制点在序列里都被复制，但是我们将序列上全部的8704个特征视为个体的基因。我们使用在BRB Array Tools（见方法）中运行的两类比较算法来调整错误发现率的置信水平和可允许的错误发现基因的最大值。因而，被以比例为2或0.5加入到不同实验组中（e.g.,对照组vs.RNA和对照组vs.混合组)的mRNAs将一致地显示在特征基因谱上，而以比例1加入的那些则不会显示（表2）。在选择的条件下（置信水平95%，10个可允许的错误发现），我们在都没有加入alien apike3（表2和Additional file2:Table s2）的RDX组和混合处理组的蚯蚓中分别鉴定出151种和96种特征基因，说明在加入alien spike 3的mRNA中没有假阳性。在两个加入相同的Alien mRNA spike-in mix 的实验组中（对照组vs.TNT组），我们鉴定出包括alien spike 3 的5种和阴性对照组的9种在内的957种特征基因，且所选推测条件和大量所谓的特征基因使其成为合理存在。因此，spike-in RNAs的应用允许我们在一个可接受错误发现率的数据组中鉴定出实验组之间至少双重的差异表达。这一尝试同样确认了用在数据分析上的统计程序，并使我们对推测的特征基因有了更大的自信。

为了进一步增加推断的严格性，并且选出较小数目的基因用于未来的实验验证，我们使用以下的标准：一个基因必须在处理组和对照组之间，显示出两处复制点上的统计显著差异，才可以被推断为差异表达的基因。在使用这一标准之后，与对照组相比（两点各占一个基因）（图2），我们在TNT处理组蚯蚓中鉴定出321种差异表达基因，在RDX处理组蚯蚓中鉴定出32种，而在混合处理组中鉴定出6种。3个基因在三种处理实验中都被显著修改，24个基因在TNT处理组和RDX处理组中是相同的，在三种处理实验中有302个基因是特殊的。图3标出了所推断的全部329种基因。Additional file3:Table S3(a)还给出了它们的注解信息。20个使用特征基因组的蚯蚓mRNA样本的多维等级分析（等同于主成分分析；图4）和分级群聚表明TNT处理组与对照组之间的巨大的差异。来自对照组和TNT处理组的样本形成了两个很好的分离集群，同时，来自RDX处理组和混合处理组的样本形成了第三种未被分辨的集群（图4）。这些结果显示TNT处理组蚯蚓的基因表达谱与对照组的基因表达谱差别最大，RDX处理组和混合组处理组的基因表达谱不能被分离。这三个处理实验中基因表达谱的差异源于对329个特征基因的修改程度，这一点被证实在绝对平均表达和相对平均表达里都高度相关（表3）。只在极少数情况下（9/658或者1.4%），被TNT暴露改变的基因会显示出与RDX处理组或混合处理组的规则相反的方向。但是，这些情况没有一个达到统计显著性程度，而且，9例中有7例发生在一个复制点（Additional file3:Table S3(a)).

表1:56天蚯蚓生殖毒性试验的结果。数据给出了平均值正负标准误差（n=20个罐子，每个罐子有5只成年蚯蚓），后以一个字母指出与对照组（ANOVA)的显著性（如果显著，plt;0.05)或非显著性（如果相同，pgt;0.05)差异。TNA和RDX的名义浓度分别为50mg/kg 土壤和30mg/kg土壤。

讨论

我们使用一个4K cDNA微阵列描述暴露在TNT（50mg/kg土壤），RDX（50mg/kg土壤）或者两者混合情况下蚯蚓的基因表达。与我们之前的研究相一致^[10],我们鉴定出与被TNT影响的多路径有关的基因，这些基因涉及的路径包括：氧运输和铁平衡（铁蛋白），血液凝固和纤维蛋白溶解（纤维蛋白原和纤维蛋白连接素），肌肉收缩和细胞运动（肌动蛋白，原肌球蛋白，肌钙蛋白），免疫应答（几丁质酶和肽聚糖识别蛋白），抗氧化反应（金属硫蛋白，谷胱甘肽S转换酶，细胞色素C氧化酶和NADH脱氢酶），钙信号（中心体蛋白和其他包含有钙结合表皮生长因子结构域的蛋白），蛋白质降解（溶菌酶破坏和泛素华）。我们还观察到之前未检测到的一小部分转录组的差异表达。这些转录不仅涉及到之前已经鉴定出的生物路径（包含血影蛋白重复或者包含结合域和一个类Kelch蛋白的肌动蛋白在内的蛋白全都涉及到细胞死亡），还涉及到许多重要的、之前未鉴定出的生物路径（Additional file3:Table S3(a))。这些新鉴定出的路径包括核糖体构建、翻译、转译后的修饰，蛋白质转换、蛋白质运输，非溶解体蛋白的降解，蛋白质相互作用，蛋白质抑制，能量平衡，糖酵解和许多信号传递路径（碳酸化作用和ADP糖基化作用）。为了支持我们之前有关不利的神经学效果的表现，我们观察到几个基因表达的重要改变，这些基因涉及到缺口和聚集蛋白信号路径，此路径分别阻碍神经元的分化^[13]和调节肌肉神经接点处的乙酰胆碱受体^[14]。

一个平衡的环形杂化方案，用于四个实验组，使用了5个独立的生物复制样本。环代表试验样本。示例代码：0.x=溶解剂对照蚯蚓的基因复制样本乘以浓度；1.x=30mgRDX/kg 土壤处理组蚯蚓的基因复制样本；2.x=50mgTNT/kg 土壤处理组的蚯蚓的基因复制（T);3.x=50mgTNT和30mgRDX/kg 土壤处理组的蚯蚓的基因复制样本（M）;x=1-5.箭头表示各自样本之间的阵列杂化，箭头的头表明Alexa 647染色标记，箭头的尾表明Cy3染色标记。杂化的更多细节请参见Additional file1:Table S1。

所有的化学处理组都引起了复制产出的显著减少。因此与复制功能有关的转录产物对基因表达的表型效应有着重要意义。在329种特征基因，有一种为海胆粘连蛋白编码的转录产物涉及到卵子形成。海胆粘连蛋白，一种二聚的半乳糖基结合蛋白，存储在海胆卵透明层（细胞外基质）的内部^[15,16]，可能与蚯蚓产茧过程有关。这种转录产物的表达降低可能是造成处理组中蚯蚓的茧和亚成体数量减少的原因。

图1

表2：Alien mRNA添加mix 合成物，每6微升的cDNA合成反应使用0.5微升的添加Mix。Mix1加入对照组和TNT处理组，Mix2加入RDX处理组和TNT RDX处理组。

有个异常的差异表达转录产物与包含TIR功能区的髓样分化因子88（E=2*10^-13)（Additional file3:Table S3(a))。这一转录产物的出现说明蚯蚓拥有Toll或者Toll样受体信号通路，这与目前的观点相反^[17,18]。秀丽隠杆线虫需要TIR功能区来抵抗微生物病原体这一点已被证明^[19]。我们的数据显示这种基因在所有处理组的蚯蚓中都是表达降低的（Additional file3:Table S3(a))，说明暴露在爆炸性化合物中弱化了赤子爱胜蚓的先天免疫系统，这一点与我们之前发现的相一致^[10]。为了鉴定其他Toll相关基因并建立赤子爱胜蚓体内这种高度保守的生物路径，我们正进行下一步的研究。

图2：与使用BRB Array Tools推测的对照组对比，3个处理组中，差异表达基因的重叠部分及数目

图3：对比对照组（每个实验5只蚯蚓），暴露在3TNT,RDX或者TNT RDX中的蚯蚓的329种差异表达转录产物的热图。使用Euclidean距离和平均链接，样本和基因都分层次集群。（系统请参见Additional file 4:Figure S1 and Additional file 5: Figure S2 for dendrograms）

图4：20只蚯蚓mRNA样本的多维定标分析，使用Euclidean距离和329种特征基因的表达数据集。颜色编码：绿色=对照组，红色=TNT，黑色=RDX，蓝色=混合组。

令人意外的是，微阵列数据显示TNT对蚯蚓基因表达的影响最强。TNT显著改变了329种特征基因中的绝大部分，而TNT和RDX的混合物却没有改变那么多（图3和Additional file3:Table S3(a))。TNT对基因表达更大的影响是生殖毒性结果中的反向累加效应，就生殖毒性结果而言，TNT和RDX的混合物的影响更大（表1）。虽然TNT暴露对基因表达效果有主导作用，混合物对某几个基因有更强的作用，而这些基因的表达不受到TNT或者RDX的显著影响（Additional file3:Table S

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