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高粱（Sorghum bicolor L. Moench）种子期间碳氮代谢酶活性的变化

发展

reda ben mrid1, youssef bouargalne1, redouane el omari1, ourdin el mourabit2, mohamed nhiri1 *

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丹吉尔科学与技术学院生物化学与分子遗传学实验室，BP 416,9000000 Tangier，Morocco

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丹吉尔地区农业研究中心，78 Avenue Sidi Mohamed Ben Abdellah，丹吉尔90010，摩洛哥

收稿日期：2017年10月16日/修订日期：2018年1月17日/接受日期：2018年1月18日

Ⓒ韩国作物科学学会和Springer 2018

摘要

碳和氮代谢途径受复杂机制调节，以优化植物的生长和发育，并在确定谷物中储存的蛋白质量中起主要作用。本研究旨在确定某些关键的碳和氮代谢酶在开发高粱种子中的作用。高粱（L.）Moench在生长室中生长。在不同的发育阶段收获种子并用于分析碳和氮代谢的某些关键酶。使用单因素方差分析（ANOVA）进行统计学分析，然后进行Tukey检验。结果表明，在种子发育过程中，在最大种子灌浆期（15-20 DAP）检测到谷氨酰胺合成酶，谷氨酸脱氢酶，磷酸烯醇丙酮酸羧化酶，苹果酸脱氢酶，异柠檬酸脱氢酶和天冬氨酸氨基转移酶的最高活性。因此，在最大种子灌浆阶段这些酶的较高活性可以与氨基酸合成有效地相关，并因此与蛋白质储备的沉积有关。

关键词：高粱，碳代谢，氮代谢，籽粒灌浆，蛋白质合成

介绍

高粱是发展中国家重要的主要粮食作物。它是许多国家超过5亿人的主食，超过50％的全球收获发生在非洲（Che et al.2016）。因此，提高高粱谷物的营养质量是改善营养状况的有用策略，特别是对于世界上的弱势地区（Che et al.2016）。

在植物发育所需的所有矿物元素中，氮是植物所需的最大量的氮，并且是显着限制谷类作物生产力的因素。通过谷氨酰胺合成酶（GS）和谷氨酸合酶（GOGAT）的协同活动将氮同化为氨基酸（Forde等人，2007）。然而，当铵以最大量存在时，其他代谢途径可以进行铵同化。下

穆罕默德·尼希里（L8）

电子邮件：med.nhiri@gmail.com

在这些条件下，谷氨酸脱氢酶（GDH）催化谷氨酸可逆脱氨基化为2-氧戊二酸，已被提出在铵同化中发挥作用（Setieacute;n等人，2013）。结合到谷氨酰胺和谷氨酸中的氮可以重新分配到其他氨基酸，主要通过转氨酶或氨基转移酶的作用作为天冬氨酸氨基转移酶（AAT），其催化氨基从谷氨酸到草酰乙酸（OAA）的可逆转移以形成天冬氨酸和2- oxoglutarate（De la Torre等人，2014）。

磷酸烯醇丙酮酸羧化酶（PEPC）是一种细胞溶质酶，广泛存在于细菌，绿藻和高等植物中（OLeary等，2011）。PEPC在HCO ^minus; 存在下催化磷酸烯醇丙酮酸（PEP）的不可逆beta;-羧化以产生OAA。PEPC还实现必需的非光合功能，特别是三羧酸循环（TCA）中间体的补充补充。

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这种补缺功能对于生物合成目的和氮同化是必不可少的（William等人，2012）。事实上，PEPC产生的OAA然后在TCA循环中被NAD-苹果酸脱氢酶（NAD-MDH）还原为L-苹果酸（Doubnerovaacute;和Ryscaron;lavaacute;2011）。产生的苹果酸被转化为柠檬酸盐，这将使TCA循环从线粒体输出到胞质溶胶中。此时，NADP-异柠檬酸脱氢酶（ICDH）可用于产生2-氧代戊二酸（Mhamdi等人，2010）。由PEPC，MDH和ICDH的作用产生的碳可以被氮同化机器用于产生氨基酸。

碳和氮的代谢是高度相互依赖的。这两种代谢途径在确定谷物中储存的蛋白质量中起主要作用。种子中储存蛋白质的积累涉及营养器官的N-再活化，这是一个涉及负责氮同化的酶的过程，以及为氨基酸合成提供碳骨架的其他必需过程（William等人，2012）。这些酶在高粱种子中研究很少。因此，本研究旨在帮助理解碳和氮代谢之间的相互作用，开发高粱种子，并关注碳和氮代谢的一些关键酶，如：PEPC，MDH，ICDH，GS，GDH和AAT。这可以提供增加高粱谷物营养品质的有效手段。

材料和方法

该研究于2016年5月至9月在丹吉尔（摩洛哥）的科学与技术学院生物化学与分子遗传学实验室进行。

化学制品

所有化学品和生物化学试剂均购自Sigma，除了磷酸烯醇 - 丙酮酸（PEP）和beta;-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸还原二钠盐（NADH），其购自Roche Diagnostics（Mannheim，Germany）。beta;-巯基乙醇从Amresco（Palm Harbor，FL，USA）获得，Bradford试剂从Bio-Rad（Hercules，CA，USA）获得。

植物材料和生长

选择摩洛哥高粱（L.）Moench生态型（谷物高粱）用于该研究。这种生态型是从摩洛哥西北部收集的，经过五个选择周期后使用。高粱生长在生长室中。生长室中的环境条件为：16小时光照/ 8小时夜晚，28℃白天/ 22℃夜晚，相对湿度范围为70-75％，光照强度为150mu;mol/（m² s ）。在不同的发育阶段收获种子如下：5（I），10（II），15（III），20（IV），25（V），30（VI）天

花后（DPA）和干种子（VII）。在每个发育阶段测量鲜重种子并立即储存在-80℃。

GS，GDH，NADH-MDH和AAT的提取和分析

将全种子在冷却的研钵中在含有14mMbeta;-巯基乙醇的50mM Tris-HCl缓冲液（pH8）中研磨，

1.4mM甘油，9.4mu;M亮抑酶肽，16.5mu;Mchymostatin，10mM谷氨酸，1mM乙二胺四乙酸（EDTA）和0.5mM MgSO 4₄。将匀浆在4℃下以20,000xg离心30分钟以获得澄清的上清液。上清液用作酶提取物。如Shapiro和Stadtman（1970）所述，使用转移酶测定法测量GS活性。如Sarasketa等人所述，GDH活性在胺化方向上进行。（2014）。如Setieacute;n等人所述测定NADH-MDH活性。（2014）。通过Rej（1979）描述的方法测量AAT活性并进行一些修改。测定混合物含有：Tris-HCl 50mM，pH 7.8，L-天冬氨酸50mM，2-氧代戊二酸10mM，NADH 0.1mM，2U MDH和20mu;l种子提取物。通过加入2-氧代戊二酸引发反应。

PEPC和NADP-ICDH的提取和分析

将全种子在冷却的研钵中在含有10mM MgCl 2,1.4mM甘油，1.4mMbeta;-巯基乙醇，1mM苯甲基磺酰氟（PMSF），1mM EDTA，1mM EGTA的100mM Tris-HCl缓冲液（pH8）中研磨， 9.4

mu;M亮抑酶肽，16.5mu;Mchymostatin，。将匀浆在4℃下以12,000times;g离心15分钟。然后将上清液用固体硫酸铵饱和（60％）30分钟。将饱和上清液在相同条件下再次离心，将得到的沉淀重悬于提取缓冲液中并用于酶测定。如El Omari等人所述测量PEPC活性。（2016）。根据Magalahaes和Huber（1991）测量NADP-ICDH活性并进行一些修改。测定混合物含有：50mM磷酸钾缓冲液（pH7.5），1mM MnCl₂，1mM NADP 和4mM异柠檬酸盐。

估计蛋白质

使用BSA作为标准，通过Bradford（1976）的方法估计蛋白质。

PEPC和AAT的非变性PAGE

将样品在4℃（80V，3小时）下提供给非变性聚丙烯酰胺凝胶。蛋白质迁移后，将凝胶在含有PEPC活性，100mM Tris-HCl，pH8,40mM NaHCO₃，30mM MgSO 4₄和2.5mM PEP的反应介质中温育。

对于AAT活性，通过在由100mM Tris-HCl缓冲液pH 7.5,40mM L-天冬氨酸和5mM 2-氧代戊二酸组成的溶液中温育来凝胶化凝胶。孵育15分钟后，从培养基中取出凝胶

用蒸馏水冲洗。然后通过染色方法使用溶于100mM Tris-HCl，pH8的0.3％（w / v）Fast Violet B盐检测对应于PEPC和AAT的条带（Ben Mrid等人2016）。

统计分析

PASW统计版本18用于所有统计分析。进行单向ANOVA模型和Tukey的事后检验以确定平均值之间的显着差异（P lt;0.05）。

结果

在不同的发育阶段种子鲜重

图1显示了高粱种子的鲜重

从第一阶段到第四阶段逐渐增加，在第六阶段保持稳定直至第六阶段，之后略有下降。另一方面，不同阶段之间高粱种子鲜重的百分比与鲜重的增加成反比。事实上，这个百分比在第一阶段和第二阶段之间是100％，然后在阶段V和阶段VI之间减少到2.6％。

GS和GDH在不同发育阶段的种子活动

这里显示的结果表明，在种子发育的早期阶段，氮代谢中涉及的酶（GS和GDH）相对较高（图2）。然而，在种子发育期间这两种酶的活性变化是不同的。事实上，GS活动（图2A）从第一阶段到第四阶段几乎保持稳定，在第五和第六阶段减少，然后再次略有增加

图1.高粱双色种子的发育阶段。a：发育阶段：开花后的5（I），10（II），15（III），20（IV），25（V），30（VI）天（DPA）和干种子（VII）。b：鲜重的变化。不同的字母表示5％的显着差异。

图2.不同高粱种子发育阶段的GS（A）和GDH（B）活性。每个值代表六次重复的平均值。不同的字母表示5％的显着差异。

图3.不同高粱种子发育阶段的PEPC（A），MDH（C），AAT（D）和ICDH（F）活性。每个值代表五次重复的平均值。不同的字母表示5％的显着差异。（B）和（E）：分别在凝胶PEPC和AAT活性中。

从第六阶段到第七阶段。另一方面，GDH活性（图2B）从I期升至IV期，之后逐渐降至VII期。

PEPC，MDH，AAT和ICDH在不同发育阶段的种子活动

在高粱种子发育的不同阶段，PEPC活性增加（图3A）。事实上，它增加到第四阶段，在阶段V和VI减少，并在第七阶段达到峰值。通过天然凝胶获得的PEPC活性凝胶测定（图3B）证实了这些结果。因此，观察到在IV和VII阶段PEPC的条带强度的增加。PEPC多肽（440kDa）的大小在植物中针对PEPC描述的分子量范围内（Gennidakis等人，2007）。关于NADH-MDH活性，它在高粱的早期阶段（10 DAP）更高

种子发育随着成熟期的进展而减少，并从第VI阶段再次增加到第VII阶段（图3C）。

在该研究中，显示ICDH活性从I期逐渐增加至III期并随后减少（图3F）。对于AAT活性，在最大填充阶段（II-IV）观察到增加，在阶段III处观察到最大值（图3D）。AAT种子活性的非变性-PAGE证实了酶活性测量中获得的结果。因此，获得了两种同种型;被称为AAT-1的较慢迁移带具有约99KDa的天然分子量，而较快迁移带被设计为AAT-2并具有80KDa的天然分子量（图3E）。基于天然聚丙烯酰胺凝胶中AAT同工酶的染色，AAT-1似乎在高粱种子中更高表达。

讨论

种子鲜重从花后5至30天（DPA）增加，然后在35DPA下体重减少，表明发育中的种子在30DPA后进入干燥期。该结果与先前关于甘蓝型油菜种子发育的研究一致，其中作者得出结论，水溶性部分在5DPA时增加至最大值然后下降（Hajduch等人，2006）。在此之后，蛋白质含量和种子脂肪酸显着增加（Hajduch等人，2006）。

Hadzi-Taskovic（1984）表明，在不同玉米基因型的贮藏蛋白强化合成期间，GS活性增加。在小黑麦种子中，Grabowska等。（2012年）报告在第一天的15天GS活动增加。在此阶段后，GS活性显着下降。种子发育早期的GS活性高，证实了这种酶在同化氮再活化产生的氨中的关键作用（Masclaux-Daubresse等，2010）。因此，在小麦中，GS活性显示与谷物氮含量正相关（Habash等，2007）。类似地，在玉米中，发现了GS活性，胞质GS基因座（gln1）和谷物产量的QTL重合（Hirel等人，2007）。关于GDH，我们的结果与Grabowska等人观察到的结果一致。（2012）并且在早期种子发育阶段观察到高GDH活性。主要在最大填充阶段发生的胺化GDH活性的增加可能表明两种酶（GS和GDH）连续起作用以控制籽粒灌浆;GS将在同化阶段首先在植物发育的早期阶段运作（Zhang et al.2017），而GDH则宁可参与控制同化物在再生阶段（当它被诱导时）的转运（Coque et al.2008） ）。很明显，GS与其他关键酶一起发挥作用，使植物能够平衡植物不同部位的碳和氮代谢。另一方面，有力的证据表明GDH在氮代谢中的关键作用（Miflin和Habash 2002）。实际上，GDH可以作为GS / GOGAT循环的分流器来释放酮酸，并且在某些情况下能够合成具有低C / N比的分子（Miflin和Habash 2002）。因此，这些两种酶是导致种子灌浆期间可能影响谷物产量的关键反应的原因（Duboi

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