水产养殖中的微生物宏基因组学：进一步深入该研究活动的潜在工具外文翻译资料

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题 目 Microbial metagenomics in aquaculture: a potential tool for a deeper insight into the activity

水产养殖中的微生物宏基因组学：进一步深入该研究活动的潜在工具

Marcel Martınez-Porchas Francisco Vargas-Albores

摘要：在过去几十年中，微生物在水产养殖中的使用和研究早已经屡见不鲜。宏基因组学是基因组学相对近期的一个分支，它的出现是为了作为一种有前途的科学工具来分析在微生物群落中的复杂基因组。尽管宏基因组学有很大的潜力，但它在如水产养殖业的农工业学科中的使用还不常见。在这篇综述中，我们分析了水产养殖业中宏基因组学的一些潜在使用，从而突出了养殖系统中微生物多样性和动态的重要性。这篇综述阐述了宏基因组学在微生物多样性、微生物在微观世界中的作用、抗生素抗性基因、新的和潜在致病菌、微生物群落形成生物絮体以及原生菌等研究中的一些潜在运用。

关键词：抗生素抗性基因；水产养殖业中的宏基因组学；微生物动态；新基因；新生物功能

引言

近几十年来，水产养殖业对人类社会的利与弊得到了广泛的关注(Martinez-Porchas amp; Martinez-Cordova 2012)。通过不同学科的衔接，水产养殖所提供的大部分好处已经实现，从而推动了可替代的和更有效的养殖实践和技术的发展。这主要包括强化活性、最佳配方饲料、可培养的新物种、转基因生物、可循环系统、多营养的培养系统以及生物絮体和生物膜的技术 (Glencross et al. 2007; Azim amp;Little 2008; Troell et al. 2009) 。

值得一提的是，微生物作为环境生物标志物、流动的生物修复剂、养殖物种的益生菌和直接食物的使用在过去几十年中得以迅猛发展 (Ezemonye et al. 2009;Caruso 2013; Mart_ınez-C_ordova et al. 2015) 。尽管微生物的使用有如此有力和连续的增长，但大多数旺盛生长于养殖环境中的细菌物种和它们特定的微观作用仍然不为人所知。例如，生长于大多数环境中高达99%的细菌物种相对不易培养，从而导致微生物多样性甚至很难用于基础研究(Streit amp; Schmitz 2004)。

前人已经做了许多关于获取更多有关微生物动态和多样性的细节信息的努力。然而，例如修饰和选择培养基、培养和分离技术以及成像和形态学(Hassen et al. 2001;Handelsman 2004)等传统方法都不能对解释不可培养微生物的巨大的未知多样性起到足够的推动作用。此外，包含于微生物学书籍中和科学研讨会中的绝大多数信息来自于微生物在纯培养基中实验中的结果，这些结果所考虑的条件有时和自然中观察到的截然不同（Handelsman 2004）。

宏基因组学（Metagenomics meta意味着超越；超越单个基因组研究）作为一个有前景的核心事物出现于过去十年，并企图分析在微生物生态位中的复杂基因组(Nielsen et al. 2014)。因此，DNA的分离可以提供有关生活在特定环境中微生物的多样性信息和能内在揭示有关其功能和生物作用的信息，而不是在实验室中培养和观察来自某一微生物群落的活微生物。在这方面，Handelsman(2004)宣称：“微生物的研究已经不仅仅是停留在问lsquo;谁在那？rsquo;的阶段，而是到了要一个困难而又重要的问题的阶段lsquo;它们在那干嘛？rsquo;。”

宏基因组学的研究领域可以一分为二：环境单基因调查和在任何环境中任何可获取基因的随机鸟枪研究（图1）。基于单基因调查的宏基因组学主要集中特定基因的研究，而这种特定基因通常是利用聚合酶链式反应扩增和利用直系同源物或旁系同源物测序和分析的。相反，随机鸟枪法研究理论上覆盖所有基因的某一特定样品中分离出来的所有DNA的测序。然而，这并没有在实际中发生，因为到目前为止还没有足够的技术可以从一个环境中随机采集的样品中测序成千上万种不同细菌的所有基因组(Gilbert amp;Dupont 2011)。因此，研究人员会被扩增和测序过程种获得的基因片段所限制。基于聚合酶菌落和源自单一分子的PCR扩增子的产生的第二代测序已经在小型基因组学和环境基因组学上取代了Sanger测序 (Porreca et al. 2006; Wooley et al. 2010) 。

出人意料的使宏基因组学在水产养殖业中的使用还不算广泛。事实上，宏基因组学主要运用在医学和生态学等学科中。运行宏基因组学技术的高成本成为其主要缺点，并且其只被证实对人体健康和对微生物学家理解环境中的微生物的动态有重要性(Steele amp; Streit 2005; Kurokawa et al. 2007)。然而，宏基因组学技术和测序技术的成本在过去的5年中急剧下降，如今已经可以在个体实验室中运用。

本研究的目的是分析宏基因组学在突出快速发展的如水产养殖等生物技术活动中的潜在应用和这子学科能够解答的问题。

宏基因组学在水产养殖中的潜在使用

水产养殖本身能被认为是微生物增殖的人工介质。例如，海洋微生物基因组数据库包含大约4000亿个碱基对的DNA，其中3%可以在1毫升海水中被发现。此外有证据表明1毫升海水中可能存在100万细菌(Gilbert amp; Dupont 2011)。在水产养殖中，氮磷代谢物和有机物含量十分丰富，这也使水产养殖地成为增殖微生物的理想媒介；正是这个原因，水产养殖设施中微生物DNA的多样性可能会更高。

以上情况表明，目前水产养殖的微生物信息可能只能代表整个世界很小的一部分。如果没有基因组技术不可培养微生物的完整多样性和理论作用很难被探明；宏基因组学和与化学生态学耦合的功能基因组学可能能解答这些问题(Riesenfeld et al. 2004)。

图1 宏基因组方法的简单图解（取自Banik和Brady，2010，当前微生物学观点），（1）直接从环境中提取分离环境DNA；（2）将DNA片段克隆到培养的宿主细菌中；（2a）文库（或cDNA）可以富集感兴趣的DNA ；(2b)转移到另一个异源宿主中或直接筛选；（3a）基于同源的办法和（3b）功能筛选法是寻找生物活性小分子的两种方法。此后，（4a）基于同源筛选发现的新序列（5）能监测在异源表达实验中编码新的小分子生物合成的能力。功能筛选的命中特征能直接引导（4b）生物活性小分子和他们生物合成基因簇的识别。

水产养殖中的微生物研究主要关注微生物与真核生物（如鱼类、甲壳纲动物和软体动物）的共生和拮抗关系。在这个方面，通过由特定宿主生物或生态环境中提取的DNA揭露的相关信息，宏基因组学可以对这些关系提供更深入的洞察

(Suttle 2007; Gianoulis et al. 2009) 。例如，细胞内致病菌很难被分离，因为它们中的一些是细胞内专性微生物，只能在半水和/或细胞培养基中培养(Avila-Villa et al. 2011)。新的测序和生物信息学技术不仅可以研究细胞内细菌的多样性，而且可以阐明来自这些群落的相关基因组信息。

近年来，与宏基因组学相关的可负担成本已经将微生物生态学转化为一种既可定性又可定量的工具。宏基因组学允许研究人员随时空模式研究特定微生物或基因的多样性和数量，并在给定的微生物群落和宿主基因型或表型之间形成更强的关联性(Monchy et al. 2011; Gilbert et al. 2012; Quince amp; Lundin 2013)。

在Wooley等研究中可以找到一个精炼的采样指南，包括采样（样本大小、过滤和记录宏数据）、组装（覆盖和宏基因组组件）、基因调用、物种多样性、功能注释和比较元基因组学。

微生物多样性

有证据表明，水产养殖设施中微生物的多样性远未被阐明。如上所述，因为存在不可培养的物种，所以微生物的培养基绝对不足以研究清微生物群落的多样性。在这方面，宏基因组学可以提供更多的证据来使人更加了解水产养殖设施中的微生物的多样性。现在可以通过分析原核生物的16S rDNA 和真核生物的18S rDNA 的超变量区域来阐述微生物多样性的巨大程度(Not et al. 2009;Hugerth et al. 2014)。

尽管宏基因组学是一个基因组学分支，但前者的研究难度却相当高。而在培养的微生物中，基因组信息是从单个克隆获得的，基因序列的组装和分析是易于处理的，但是宏基因组学会从含有成千上万种物种的异质微生物群落中产生噪音数据和部分数据，而这对生物学家和生物信息学家是一个挑战(Wooley et al.2010)。

使用宏基因组学分析微生物多样性需要设计针对保守区域的引物，这些区域可以扩增为各种生物提供分类学身份的片段。16S rRNA基因的V1至V9的变异区和18S rRNA基因（rDNA）的V1至V9区已被用于多年的分类学鉴定(Lane et al. 1981; Frank et al. 2008)。

数十种引物已经被设计用于微生物群落的定性和定量分析。例如，Wang和Qian（2009）从核糖体数据库（RDP）中鉴定了16S rRNA基因中的保守片段，编制了30份候选引物的清单，并将其与文献中记载的常规引物进行比较。其作者报道其引物的覆盖率为96％，远高于广泛使用的引物的覆盖率。在这项工作中可以找到推荐的引物列表。

微生物多样性的一些研究在水产养殖中已经开展。例如，Krishnani等人 （2010a，b）描述了沿海水产养殖绿色水体系中硫氧化细菌的多样性；作者记录了意外存在的假黄单胞菌sp（硫化物营养缺陷型gamma;-变形杆菌。这些结果解释了尽管该地进行了水产养殖活动，但该地区的硫含量维持在规定的安全水平以内。 其他一些涉及16S rDNA的研究已经着手了养殖鱼类、软体动物和甲壳类动物的原核微生物多样性(Xing et al. 2013; Chauhan et al. 2014; Tang et al. 2014)。为了获得更好的鱼类养殖的益生菌，通过16S 和 26S rDNA的分析的酵母生物多样性研究已经被实施(Navarrete amp; Tovar-Ramırez 2014);26S 也被用于研究真菌群落(Heinrichs et al. 2013)。

虽然已经对16S rDNA的相关区域进行了充分描述，以便能够以可靠的方式鉴定原核生物，但18S rDNA并非如此。根据Hugerth et等人叙述到（2014），“尚未有真实的18S rDNA引物设计的系统设计来解决真核生物多样性研究问题的报道”。这些作者设计了一套基于31,862个18S rDNA序列的广泛分类学范围的简并PCR引物，并用针对V4区域的引物表达出了更好的表现，允许用短至150bp的双末端读数进行区分，其精确度为75％种水平和90％的科水平。根据这些评估，V4和V5是信息最丰富的区域。一个明显的事实是这两个区域可以通过NGS平台（Illumina or Ion Torrent）结合使用组合引物， 从而产生与通过焦磷酸测序获得的长读数相当的鉴别序列。因此，考虑到以前的分析，Hugerth等人的手稿中报道的引物组可能对从不同环境中检测真核生物很有帮助，而且评估结果偏差很小。

进行真核生物多样性研究的复杂性可反映在水产养殖中进行的这些调查的稀缺性;然而，有一些真核生物可以通过18S rDNA鉴定的例子。 例如，Santos等人（2010）构建了18S rRNA基因文库，并揭示了一个可用作污染监测的潜在生物指标的微生物真核细胞群的存在。其他研究集中在与海洋生物相关的真核生物多样性研究上（Wegley et al.2007）。然而，最近没有在文献中报道过其在水产养殖中的应用。因此，这代表了一个广阔的科学研究领域，可能有助于解决水产养殖中微生物世界出现的一些问题。

微生物在微观世界中的作用

基因被认为是任何生物体基因组中的基本功能单位，构成转录单位，操纵子和网络。基因发现算法已被设计用于鉴定单个物种基因组内的开放阅读框，而Wooley等人所述（2010），由于宏基因组学数据的不完整性和零碎性，这些信息对于宏基因组学来说是难以获得或难以获取的。然而，Mavromatis等人（2007）报道，基于低复杂度宏基因组学数据集的基因预测可以精确到90％，高复杂度组的平均准确率为85％。此外，BLASTing是用于搜索已知同源物的基因的常用方法，该基因也可用于鉴定宏基因组中的基因种类成员的存在（Azad＆Borodovsky 2004）。BLAST的一个缺点是，它不适用已知数据库中没有同源物的新种类和新基因（Wooley et al.2010）。

尽管存在上述复杂情况，但仍有一些好的方法可以解决宏基因组数据分析的复杂性，以找到同系物和新种类与基因。此外，还有其他一些值得考虑的好方法（Hoff et al.2008; Yooseph et al.2008），以及可能在近期/中

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