响应面法优化微波-超声波提取核桃粉的酚类化合物外文翻译资料

响应面法优化微波-超声波提取核桃粉的酚类化合物

摘要

背景：中国药典中记载，核桃是一种传统的食物，也是一种传统的药材；但是在核桃油的生产过程中产生的大量核桃粉并没有得到很好的利用。

目的：本研究通过超声波-微波辅助水醇提取法提高从核桃粉中提取的总多酚含量。

材料和方法：采用响应面法对总多酚含量提取工艺参数进行了优化，包括微波功率（20-140W）、超声波功率（75-525W）、提取温度（25 - 55℃）和时间（0.5-9.5min）。多酚组分用液相色谱-质谱联用仪分析。

结果：一个二阶多项式模型较好地拟合实验数据（R²=0.9932,Plt;0.0001,R²_adj=0.9868）。优化的快速提取工艺条件为微波功率294.38W、93.5w超声功率、温度43.38℃、时间4.33min，最大总多酚提取量是34.91mg GAE/g，这是一种快速提取。在核桃粉提取物中的主要酚类成分是、鞣花酸、没食子酸，最高峰分别为22.15%、14.99%和10.96%，可作为保健食品、化妆品和药品的功能成分。

讨论与结论：结果表明，核桃粉是制油工业的一种废物，同时也是一个丰富的多酚类化合物的来源，因此可以作为一种高附加值的功能性食品的成分。

关键词：核桃多酚；中心复合设计（CCD）；总多酚产量（TPY）；成分鉴定；液相色谱-质谱联用仪

文章历史：2016年11月8日收到初稿

2017年4月10日修订

2017年6月22日采纳

介绍

核桃因其营养、健康和感官特性（Martinez等人，2010），成为世界上最受欢迎的树坚果之一。全球核桃产量在2013年约为350万吨，中国已成为世界产量领先的生产商（170万吨），其次是伊朗（45万吨）和美国（42万吨）（粮农组织，2013年）。核桃仁是一种平常的食物，也是中国药典中记载的一种传统药物（中国2015年）。以往的研究表明核桃富含油（50-70%），蛋白质（14-24%），生育酚和酚类化合物（Gomez-Caravaca等人，2008；Miraliakbari和Shahidi，2008）。普遍存在核桃中的酚类化合物的是酚酸，缩合单宁，鞣花酸、黄酮类，这些物质有清除自由基的能力，并对体外低密度脂蛋白胆固醇的氧化易感性有保护作用（Kris-Etherton等人，1999；Anderson等人，2001；Li等人，2006）。

由于它的油脂含量和必需脂肪酸含量高，核桃历来作为是食用油来源。从核桃油生产过程中产生的剩余物-核桃粉已普遍作为肥料或动物饲料（刘和蒋，2014；Wu等人，2014）。考虑到核桃粉是酚类化合物的丰富来源（Martinez等人，2010），对核桃粉的有效开发不仅能提高核桃的经济价值，还能保护环境。然而，迄今为止很少有研究集中于核桃粉中酚类物质的回收。

提取被认为是利用酚类化合物（Lapornik等人，2005）的一个重要阶段。传统的酚类化合物的提取方法有一定的局限性，包括溶剂消耗量高，提取时间长，目标化合物可能会降解。为了克服这些缺点，我们已经开发出了几种从植物中提取天然抗氧化剂的技术，包括超声波辅助提取法（Yue等人，2012；Kazemi等人，2016）、脉冲通电加热提取（Darra等人，2012）、微波辅助提取（Mishra和Aeri，2016）和微波-超声波协同辅助提取（Ghafoor等人,2009；Pingret等人，2012）。超声波和微波相结合提供了一个有趣的方法，这将两种来源不同的能量及其各自特有的作用集中在一起。目前超声-微波协同辅助水醇提取法已经广泛使用（Zhang和Liu，2008；Nayak等人，2015），由于微波强化传热和超声强化传质的协同效应，该技术具有很高的效率。因此，将超声-微波协同辅助水醇提取法应用于多酚类物质的提取可大大缩短准备时间，提高生产效率。

响应面法（RSM）促进了对工艺参数的评估及其对响应变量的相互作用（LU等人，2013）。将响应面法和超声-微波协同辅助水醇提取法相结合，对核桃粉中酚类化合物的提取有很大的价值。

本研究的目的是（a）通过超声-微波协同辅助水醇提取法和中心组合设计法及响应面法来优化提取核桃粉中的酚；（b）研究不同参数的影响，包括超声波功率、微波功率、提取温度、提取时间；（c）通过液相色谱-质谱联用确定核桃粉提取物中的酚类化合物。

材料和方法

材料和化学品

核桃粉是由中国云南昭通鸿联公司捐赠，在实验前是放在冰箱中-20℃中保存，是用云新的核桃和铁核桃杂交的品种冷榨出核桃油之后的残渣，该杂交品种是由云南林业科学院的卢教授鉴定。福林酚试剂购自Sigma（密苏里州圣路易斯）。其他化学品（分析纯）为北京化工有限公司（中国昆明）。

微波-超声波协同辅助提取

微波-超声协同辅助提取装置（DX100，MUAEA）是从南京西安欧机械有限公司购买（中国上海）。酚类化合物的提取采用60%甲醇溶液在微波-超声协同辅助提取装置进行。提取后，提取液离心（10000rpm，10min），收集上清液后用0.22微米滤膜过滤。样品在使用前于-20℃下保存。

总酚产量的测定

对从核桃粉中提取出来的总酚产量用福林酚法进行检测（Shukla等人，2012）并对该法进行微小更改（Wang等人，2013）。简单来讲，0.1mL的样品混合1.9ml的纯净水和1.0ml福林酚试剂反应5分钟，然后加入1.0ml的20% Na₂CO₃并在25℃下反应1h。没食子酸用作比较的标准。在Ultrospec 2100紫外-可见分光光度计（Amersham Pharmacia Biotech Biochrom Ltd., Holliston, MA）于765nm处测定吸光度。结果以没食子酸的毫克当量来表示每克核桃粉（mg GAE /g）。

实验设计

为了获得最佳提取核桃粉的条件，用中心复合设计法（CCD；设计专家软件，V8.0.6，Stat-Ease Inc., Minneapolis, MN）设计实验、数据分析和模型建立。在中心点（alpha;=1.5）进行6次重复实验并选为试验点。这个中心点用于检查结果的再现性和稳定性。试验以随机方式进行以避免系统偏差。在初步试验的基础上，利用CCD的30次运行优化了主要提取条件，包括超声功率（X₁）、微波功率（X₂）、提取温度（X₃）和提取时间（X₄），如表1所示。总酚产量（mg GAE/L／100g）为响应变量Y。

表1.独立变量中心复合实验设计及观测数据与响应预测的比较

酚类成分的液相色谱-质谱鉴定

用液相色谱-质谱联用初步鉴定最佳条件下得到的提取物中的酚类成分。用安捷伦1290 Infinity系列超高效液相色谱仪器进行色谱分离（Agilent Technologies, Santa Clara, CA），该仪器设有一个四元泵（G4204A，美国）、一个脱气器、一个二极管阵列检测器（G4212B，美国），一个自动进样器（G4226A，美国）和一个柱箱（G1316C，美国）。色谱分离是在来自安捷伦科技的Agilent Zorbax SB C18柱（4.6X250mm，5mu;m粒度）上实现。把酸化水（1%甲酸，v/v）和甲醇分别作为流动相A和B。

高效液相色谱法设置成先用10%B洗脱5min，再用B梯度洗脱从10%到90%，时间从5到50min，还有最后用90%B等度洗脱60min。整个洗脱过程中，流速设定为0.5ml/min。柱温设定为30℃，注射量为10mu;m。DAD检测到紫外-可见吸收是在280nm处。质谱研究利用了四极杆-飞行时间高分辨率质谱仪（液相色谱仪四级杆飞行时间质谱仪6540系列，Agilent Technologies，Santa Clara，CA）和电喷雾电离（ESI）。该检测采用正离子模式，质谱从m/z100到2000。对电喷雾质谱的参数进行了优化，如下：毛细管电压设定在 4.5kV，氮作为干燥气体（180℃、4.0L/min）。这些数据是用Agilent Mass Hunter Workstation软件获取的。

结果与讨论

模型拟合

响应面法优化核桃粉提取总酚产量的参数，包括超声功率（X₁）、微波功率（X₂）、提取温度（X₃）和提取时间（ X₄），如表1所示。

通过F-检验评估回归模型得到统计分析。表2总结了响应面多项式模型和用方差分析（ANOVA）检测模型是否合适。对于模型中的任何时期来说，一个更大的回归系数和较小的P值都表明这对响应变量的影响更显著（滕等人，2011）。

费谢尔的F-检验具有较高的模型的F值（F=625.46）和一个低的P值（P＜0.0001），这表明模型非常显著。得到的二阶多项式模型充分代表了观察到的数据，这个数据带有R²为0.9932的总酚产量的响应，这表明实际值和预测值有良好的相关性。总酚产量的调整系数值为0.9868，这表明大部分变量可以用这模型进行预测。此外，非显著性的失拟检验（pgt;0.9）与这个模型的优点相一致。这些结果表明，响应面模型可以用来预测反应。

提取参数对总酚产量的影响

基于中心复合设计法，用微波-超声协同辅助提取装置提取的核桃粉苯酚提取物总酚得率的得到表1所示。对实验数据进行多元回归分析，并对模型的系数进行了显著性评价。影响因素中的超声功率（X₁）、微波功率（X₂）、提取温度（X₃）和时间（X₄）在总酚产量的线性模型的一阶主效应中表现显著（p＜0.01）以及它们之间的互相影响作用也显著（X₁X₃，X₁X₄，X₂X₄和X₃X₄)。因素和预测的响应值之间的多项式方程关系如下：

表2.响应面多项式模型的方差分析

所有因素的线性系数（自变量）为正，但二次系数因素为负，说明在第一阶段因素的值增加会伴随着总酚产量响应值（因变量）增大，反之亦然；在第二阶段因素的增加会降低总酚产量。

为了研究超声-微波辅助对核桃粉中提取总酚产量的影响，三维表面图（图1（A-F））是根据等式绘制的，每一个曲面图代表一对独立变量，研究它们对总酚产量的交互作用。图1（A）显示微波功率和超声功率对总酚产量的影响。当微波功率固定不变，随着超声功率的增加，总酚产量增加，直到超声功率达到最大值后再继续增加，总酚产量开始下降。同样地，当超声功率固定不变，随着微波功率的增加，总酚产量增加，直到微波功率达到最大值后再继续增加，总酚产量开始下降。类似的趋势也存在于其它相互作用的因素中（图1（B-F））。从上述观察到的情况来看，当其他因素不变时，在第一阶段，随着超声功率从40W增加到100W，微博功率从150W增加到300W，提取温度从30℃增加到45℃，时间从2分钟增加到五分钟，总酚产量提高；反之，在第二阶段中，随着超声功率从100W增加到120W、微波功率从300W增加到450W, 提取温度从45℃增加到55℃ ，提取时间从5分钟增加到8分钟，总酚产量降低。在我们的初步调查中也注意到在这些参数设置过高的情况下，总酚产量会下降，这可能与微波能量具有偶极旋转的撕裂作用或/和超声波会造成生物活性物质的降解有关（Hayat等人，2010；Pingret等人，2013；Nour等人，2016）。此外，在提取过程中的氧化联合效应以及酚类和非酚类化合物的相互影响，如糖和脂肪酸的相互作用（Pingret等人，2013）可能会降低在超声-微波辅助提取中的总酚产量。

模型的优化与验证

从求解方程来看，从核桃粉中提取多酚的最佳条件如下：超声波功率94.38W，微波功率294.38W、提取温度是43.38℃、提取时间是4.33分钟。与在传统提取方法下提取出来的酚类化合物相比，用微波-超声波协同辅助提取装置提取不仅在一个温和的提取温度下大大缩短了提取时间，也预测总酚产量的最大值为34.91mg GAE/g。使用微波-超声波协同辅助提取装置可得到较高的总酚产量可归因于微波对细胞基质有穿透能力及其与极性分子的相互作用产生生物质体积加热，从而导致植物细胞内压力增加。这种压力的增加，导致细胞壁破裂和酚类化合物的释放。此外，经过福林酚比色法测定，更多的酚类化合物分解成为较小的性质完整的原始分子也可产生较高的总酚含量（Nayak等人，2015）。

为了验证模型的充分性，用最佳提取条件进行了验证实验。从核桃粉中提取的总酚含量的实验平均值为35.12plusmn;0.27mg GAE/g，这接近响应面法模型的预测值34.91mg GAE/g。结果之间的良好一致性表明，响应模型足以反映能达到期望的优化组合，

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