高分辨质谱结合多元数据分析揭示亚洲妇女卵巢癌血浆脂质组学改变外文翻译资料

高分辨质谱结合多元数据分析揭示亚洲妇女卵巢癌血浆脂质组学改变

摘要：卵巢癌（OC）是女性妇科恶性肿瘤死亡的最常见原因。能早期诊断这种疾病的可靠生物标记物的识别是降低OC死亡率的关键。OC患者较健康人群的血浆溶血磷脂酸（LPA）水平高。因此，脂质组学可能为发现OC的诊断性生物标志物提供了极好的发展前景。在这项研究中，基于超高效液相色谱—电喷雾电离—QTOF质谱（UPLC-ESI-QTOF-MS）和多元数据分析（包括主成分分析（PCA）和（正交）偏最小值）的非靶向脂质组学方法平方判别分析[(O)PLS-DA]用于OC患者血浆中潜在的诊断性生物标志物的研究。在这种疾病中显示出显著的脂质摄取的OC患者可以通过这种方法与健康的个体和良性妇科肿瘤疾病患者区分开来。有趣的是，LPCs上调，PC和TG下调，OC组与良性肿瘤和正常对照组比较，磷脂酶代谢出现的关键途径在疾病中失调了，特别是磷脂酶A2（PLA2）的酶活性。这项研究可能为OC的潜在发生机制提供新的见解，并且证明基于MS的脂质组学是发现疾病新的潜在临床生物标志物的有力方法。

1.简介

卵巢癌（OC）是西方各年龄段妇女妇科恶性肿瘤死亡的最常见原因，2014年在美国造成约14270人死亡。OC早期（I / II期）预后良好，生存率超过90％，但在所有报告病例中的近80％发生在晚期（III / IV），5年生存率只有11％。鉴于在疾病早期治疗预后好，OC早期的可靠诊断标志物显然是非常有吸引力的。高度糖基化的CA125蛋白是FDA批准的用于诊断OC的血液测试物；然而，这个标记在为疾病的早期预警或人群筛查时缺乏敏感性和特异性。HE4是OC患者的一个新的生物标志物，在卵巢癌患者的诊断中显示出与CA125相似的敏感性和特异性，在绝经前患者中具有较好的功效。因此，确定可靠的诊断生物标记物以便早期发现这种致命疾病对于降低OC的死亡率至关重要。

脂质组学是一个不断发展的研究领域，在大规模和完整的分子水平上研究细胞脂质体。进来越来越多的证据表明，癌症和代谢疾病与脂质代谢失调有关。据报道，与非恶性疾病（例如肝衰竭）患者的腹水相比，OC患者的腹水溶血磷脂酸（LPA）和溶血磷脂酰肌醇（LPI）显著增加。另外，有充足的证据支持OC患者比健康对照的血浆LPA水平高。因此，脂质组学为发现OC的诊断性生物标志物提供了极好的发展前景。

质谱方法的多项最新进展极大地扩展了分析能力，以促进对全球脂质的精确分析，从而为脂质组学途径和功能提供新的见解。基于色谱保留，高质量分辨率和准确度的质谱LC / MS平台，MS / MS分析和定量软件可以通过LTQ-FT MS对脂滴进行复杂样品分析，从而提高检测PE的灵敏度和DG物种；通过超高效液相色谱—电喷雾电离—四极杆飞行时间质谱法报告了肝细胞癌患者的血浆代谢组学研究，下调的感兴趣的分子包括HCC患者血浆中的11个LPC为病理生物学提供了新的见解的疾病；开发了一种统一的DHB层辅助的基于MALDI-FTICR MS的方法用于快速分析来自细胞团的脂质提取物，其显示更高的通量并且更方便，为脂质组学研究提供了替代方法。因此，基于MS的脂质组学分析显着扩展了我们与人类生理和病理相关的知识。

在本研究中，基于超高效液相色谱 - 电喷雾电离 - 四极杆飞行时间质谱（UPLC-ESI-QTOF-MS）和多元数据分析（包括主成分分析（PCA））的非靶向脂质组学方法，和（正交）偏最小二乘判别分析[（O）PLS-DA]用于快速调查OC患者血浆中潜在的诊断性生物标志物。高分辨率质谱法及其相应的MS / MS数据被结合起来以鉴定这些潜在生物标志物的结构。此外，这些数据也上传到MetaboAnalyst网站（www.metaboanalyst.ca），使用MetPA软件进行途径分析以识别不受控制的途径。

2 实验

2.1 原料

从Avanti Polar Lipids（伯明翰，AL）处购买了脂质标准品1-月桂酰基-2-羟基-sn-甘油基-3-磷脂酰胆碱（12：0 LPC）和1-肉豆蔻酰基-2-羟基-sn-甘油基-3-磷酸酯（14：0 LPA）。HPLC级甲醇（MeOH），乙腈（CH3CN），异丙醇（IPA），氯仿（CHCl3），甲酸以及甲酸铵均购自Sigma或Fisher Scientific。使用来自Milli-Q纯化系统（Millipore Corporation，USA）的超纯水。所有上述材料均未经进一步纯化即被用作接收条件。

2.2 样品收集和脂质提取

2.2.1.实验参与者

亚洲女性血浆样本来自刘莹莹博士，其中包括27例OC（C组，年龄范围：37-74,55.2 7 10.7岁），27例良性妇科肿瘤（Artful法氏囊良性肿瘤，B 年龄范围：8-76,47.2 7 17.6岁）和11名未受影响的对照组（N组，年龄范围：30-71岁，45.9岁，7岁，13.1岁）入选北京大学首钢医院。将血液样品收集在含有EDTA的试管中，并在室温下以1750g离心15分钟。 将血浆样品等分入硅化的eppendorf管（SafeSeal微量离心管; PGC Scientif公司，Frederick，MD）中并在-80℃下冷冻直至使用。该项目经机构审查委员会批准，并由参与者签署了书面知情同意书。

2.2.2脂质提取

脂质通过甲醇法提取[25]。 简言之，将20mu;l血浆转移到1000mu;L含有12：0LPC（1nmol，用于阳离子检测模式下的质量控制）和14：0LPA（20pmol，用于负离子质量控制的甲醇 检测模式），涡旋并离心（10,000g，5分钟，室温），将2mu;L上清液或2mu;L10X稀释液分别加载到质谱仪中用于负离子或正离子脂质分析。

2.3.UPLC-ESI-QTOF质谱

使用UPLC-ESI-QTOF-MS（Xevo G2 Q-TOF MS，Waters）进行脂质谱分析。样品通过LC系统（I-Class Acquity超高效液相色谱，Waters）加载自动取样器。流动相A为含有10mM甲酸铵的异丙醇/乙腈/甲酸（90:10:0.1，v / v / v）流动相B是含有10mM甲酸铵的乙腈/水/甲酸（70:30:0.1，v / v / v）。使用CSH C18柱（1.7mu;m，2.1mm ID〜100mm，Waters）分离脂质。该柱维持在55℃。使用以下方案，UPLC分离20分钟/样品：（1）0分钟，70％B; （2）2分钟，57％B; （3）2.1分钟，50％B; （4）12分钟，46％B; （5）12.1分钟，30％B; （6）18分钟，1％B; （7）18.1分钟，70％B; （8）20分钟，70％B.所有的变化都是线性的，流速设定为400微升/分钟。

MS系统使用正离子（ESI ）和负离子（ESI-）两种模式运行。 m / z范围设定在100-1500。电离源温度设定在110℃。使用氮气作为干燥气体和碰撞气体。锥形气体流量设定为15L / h，去溶剂化气体流量设定为600L / h，去溶剂化气体温度设定为320℃。在正离子模式下，毛细管电压为3.5kV，采样锥电压为35V，提取锥电压为3.0V。在负离子模式下，毛细管电压为2.8kV，采样锥电压为35V，提取圆锥电压为3.0 V，多路数据采集（MSE）是一种数据独立采集模式，用于同时采集高分辨率和高精度的MS和MS / MS数据。对前面MS扫描中观察到的所有离子获得MS / MS数据。锁喷雾用于确保重复性和准确性。在ESI-（m / z 554.2615）和ESI （m / z 556.2615）中使用亮氨酸脑啡肽（200mu;g/ ml）作为锁定质量。锁定喷雾频率设置为5秒，并且锁定质量数据在总共10次扫描中被平均。

2.4 数据预处理

由QTOF获得的数据由Markerlynx XS和EZ信息软件（Waters）处理。首先，将每个离子的强度归一化，以产生由m/z值，保留时间和归一化峰面积组成的数据矩阵。接下来，用主成分分析（PCA）使用帕累托定标数据评估无监督分离。PCA数据通过绘制PCA评分进行评估;每个点表示一个保留时间/质荷比（m / z）对。因此，负荷图给出了最强烈影响评分图中的模式的脂质的指示。为了最大化类别歧视和生物标志物鉴定，使用（O）PLS-DA方法进一步分析数据，而计算S图或负荷图以可视化（O）PLS-DA数据内的协方差和相关性之间的关系。根据投影值（VIP）4 5.0中的变量重要性选择判别变量。此外，使用独立的t检验（plt;0.05）来确定从OPLS-DA建模获得的不同生物标志物候选者是否在组间具有统计学显着性。

2.5 生物标志物鉴定

通过搜索由沃特世建立的本地数据库或免费的在线数据库（包括Lipidmaps（http://www.lipidmaps.org/）和人类代谢组数据库（HMDB）（http://www.hmdb.ca））来标识这些标记），以精确匹配由MS获得的精确分子离子（质量误差le;5ppm），并通过MS / MS获得的碎片离子进一步用于确定标记。

2.6 脂质组通路的构建

使用Metaboanalyst 2.0进行OC患者潜在生物标志物的构建，相互作用和途径分析。该计划基于包括KEGG（http：//www.genome.jp/kegg/）和人类代谢组数据库（http://www.hmdb.ca/）在内的多个数据库，有助于识别最显着改变的途径。Metaboanalyst 2.0的富集分析也评估了可能的生物学作用。

3、结果和讨论

3.1 通过UPLC-ESI-QTOF-MS对血浆中的脂质进行简要分析

使用上述UPLC-ESI-QTOF-MS，我们在正离子和负离子检测模式下对血浆中的脂质进行了分析。UPLC条件进行了优化。 将BEH C18（1.7mu;m，2.1mm〜100mm，目录号186002352），HILIC（1.7mu;m，2.1mm〜100mm，目录号186003461），HSS T3（1.8mu;m，2.1 毫米〜100毫米，目录号：186003539）和CSH C18（1.7微米，2.1毫米〜100毫米目录号：1800600297），并测试了不同的流动相。 基本上，CSH C18色谱柱为脂质分析提供了可接受的分离能力[20]。血浆样品中脂质提取物的代表性总离子色谱（TICs）如图1所示。溶血磷脂在2分钟之前被洗脱，甘油 - 磷脂和鞘脂在5和13分钟之间洗脱，三酰甘油（TGs）分别为 15分钟后洗脱。 正离子检测模式下12：0 LPC或负离子检测模式下14：0 LPA峰面积的相对标准偏差（RSD）分别为4.6％或7.8％，说明MS-MS的稳定性和重现性， 基于脂质组学的方法。

3.2 （O）PLS-DA鉴别卵巢癌患者（C组），良性卵巢肿瘤患者（B组）和正常个体（N组）

使用Markerlynx XS进行峰鉴别，滤过和保留时间校正，在保留时间0.2-20分钟之间产生4 4000个峰。为了评价基于UPLC-ESI-QTOF-MS的脂质组学方法在鉴别卵巢癌患者（C组），良性卵巢肿瘤患者（B组）和正常个体（N组）中主要组分分析（PCA）的能力执行。在PCA评分图中，观察到C组，B组和N组之间的差异。 然而，C，B和N组在PCA评分图中没有很好地区分（数据未显示）。这很可能是因为人血浆样本非常复杂，PCA数据分析技术基于无监督的，随机的，与OC无关的脂质变异来分离样本。

为了进一步研究C，B和N组之间的全球脂质变化，使用监督的OPLS-DA或PLS-DA整合和共同分析所获得的所有观察结果。 OPLS-DA可用于区分2组; 而PLS-DA可用于区分2组以上。如图2A和C以及图3A和C所示，在C和B之间观察到基于来自UPLC-ESI（ ）或ESI（ - ）-QTOF-MS的数据的OPLS-DA的明确分离 组和C组和N组之间，表明脂质代谢扰动在依赖于病理状态的样品中是明显的。此外，基于来自UPLC-ESI-QTOF-MS的数据，进行PLS-DA以区分C，B和N组。 结果表明UPLC-ESI（thorn;）-QTOF-MS数据并未完全分离这3组，PLS-DA评分图如图4A所示; 然而，来自UPLC-ESI（ - ） - QTOF-MS的数据确实完全分离了这三组，并且PLS-DA得分图如图4C所示。

Markerlynx XS中的VIP分析进一步进行选择变量作为区分患者与对照的主要标记。 VIP值反映了每个变量对分类的影响。一般而言，VIP值为4 1.0的变量具有高于平均水平的影响。 在我们的工作中，使用VIP值为4.5的变量，以及相应的S图，分别显示在图2B和图2D，图3B和图3D以及加载图，图4B和图4D 。在S图或加载图中，每个点代表具有特定保留时间和m / z值的变量。 VIP值为4 5.0的变量用红框突出显示，因此选择了具有特定保留时间和m / z值的变量。总之，在阳离子检测模式下，分别选择18,22和25个变量分别用于区分C和N组，C和B组以及C，B和N组; 同样，在负离子检测模式下，选择总共18,19和16个变量分别用于区分C和N组，C和B组以及C，B和N组。这些变量有可能将患者与对照区分开来，因此值得进一步研究以确定这些潜在标记的结构，这将为今后对这些化合物功能的研究提供基础。

3.3识别C，B和N组区别的潜在标记

为了鉴定这些潜在标志物的结构，使用通过正离子和负离子检测模式获得的m/z信息从Waters或LIPID MAPS或HMDB建立的数据库中搜索匹配的脂质。 该误差设置为5 ppm。 MS /MS数据进一步证实了该结构。

在阳离子检测模式下，选择RT为5.72min和m / z为784.5838的变量作为区分C和N组的主要标记。在正离子检测模式下RT为5.72的质谱显示2个主要信号，其m / z分别为784.5856和806.5667，对应于[M thorn; H] thorn;和[M thorn; Na] thorn;。RT为5.72分钟的MS /MS数据（图5A）显示m / z为184.0740（磷酸胆碱）的

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