橙色绿屈挠菌光合电子传递链中替代配合物III的结构分析

Xinliu Gao, Yueyong Xin,, Patrick D. Bell, Jianzhong Wen, and Robert E. Blankenship

圣路易斯华盛顿大学生物学和化学系，密苏里州圣路易斯，63130，和生命和环境科学学院，杭州师范大学，杭州，310036P.R.中国

摘要：绿色光合细菌Chloroflexus aurantiacus属于丝状无氧光养动物门，不含有细胞色素bc或bf型复合物，这种复合物存在于所有其他已知的光养动物群中。这表明存在一种功能置换，将反应中心光化学与循环电子转移以及呼吸联系起来。先前的工作发现了细胞色素bc复合物的潜在替代品，现在被命名为替代复合物III(ACIII)，该复合物已从Chloroflexus aurantiacus中纯化，鉴定和表征。在光合电子传递链中，ACIII起着甲萘酚：金花青素氧化还原酶的作用，以及呼吸电子流向末端氧化酶的相关但不同的复杂功能。在本工作中，我们重点阐述了光合ACIII的结构。我们发现ACIII是一个由7种不同类型的8个亚基组成的约300kDa的整体膜蛋白复合物。其中有4个金属蛋白亚基，包括一个113kDa的铁硫簇含多肽，一个25kDa的聚体含c亚基，以及两个20kDa的单血红素含c亚基以同二聚体的形式存在。采用多种分析技术测定ACIII亚结构，包括HPLC结合ESI-MS、金属分析、电位滴定和血红素染色SDS-PAGE的强度分析。在分析数据和化学交联的基础上，结合MALDI-TOF质量分析以及跨膜和转运肽分析，提出了ACIII的初步结构模型。

关键词：无

细菌电子传递途径主要分为两大类：光驱动光合电子传递链和好氧或厌氧呼吸电子传递链。尽管光合磷酸化和氧化磷酸化之间存在巨大差异，但它们都将电子供体和电子受体之间的化学反应与跨膜质子的易位联系起来，从而驱动ATP的形成和其他能量依赖的过程（1）。因此，所有电子传输链的共同特征是质子泵的存在，以产生跨膜质子梯度。在呼吸电子转移途径中，可能有多达三种类型的质子泵蛋白复合物使人想起线粒体，这取决于环境因素（2）。 相反，所有光合电子转移链中的质子泵直到最近才被认为涉及细胞色素bc₁或b₆f复合物，在整体结构和机制上类似于线粒体复合物III（3）。

在基于16SrRNA分析（4）的细菌物种树中，丝状无氧光养动物门(FAPs)与其他含有进行叶绿素光合作用的生物体的门不密切相关：紫色细菌、蓝藻、日光细菌、绿色硫细菌和氯酸细菌。相反，它表现出更深的分支位置，其他五个细菌门，其中包含光营养代表（5，6）。 由于这一独特的特点，对FAP的研究可能为光合作用的进化发展提供一个有趣的线索。 FAPs构成了一个非常多样和独特的细菌门，包括几个属：Chloroflexus（7）、Oscillloris（8）、Chloronema（9）、Heliothrix（10）和几个在海洋环境中发现的类似Chloroflexus的细菌（11）。其中，温泉微生物群落的突出微生物Chloroflexus aurantiacus是第一个被描述的，是FAPs在光合和其他代谢途径方面研究最广泛的代表。在非常不同且多样的光养原核生物群中发现Chloroflexus aurantiacus的光合装置表现出一个有趣的组合特征。它们具有II型光反应中心和整体膜天线复合体，使人想起紫色细菌（12,13）。此外，它们还有一个外围的氯小体天线复合物（14)和一个叶绿素生物合成途径，这两种途径都与绿色硫细菌中相似(15,16)。Chloroflexus aurantiacus还含有一种独特的自养固碳途径，不同于任何其他光养生物，即3-羟基丙酸循环（17,18）。因此，Chloroflexus aurantiacus的系统发育特征和多功能光合装置表明，它在光合作用的起源和进化中占有重要地位（19）。

图1：提出了Chloroflexus aurantiacus光合循环电子转移途径。

Chloroflexus aurantiacus的一个有趣的特点是它的非凡的电子转移途径。对于所有类型的光合生物，在光能转化为化学能的初始过程之后，电子通过一系列电子载体，最终通过循环电子转移途径返回到光系统的电子供体侧，或者在非循环电子转移过程中减少末端电子受体（1）。电子转移的总体模式在很大程度上取决于生物体的类型、所占据的环境、是否进行有氧或厌氧代谢，以及存在何种类型的末端氧化剂和还原剂。虽然电子转移途径在不同的光养生物群中似乎有很大的不同，但直到最近，一个成分一直被认为是所有光合系统中的一个恒定成分：细胞色素bc₁或b₆f复合物，它将电子从喹诺转移到可溶性细胞色素c或花青素，同时在膜上转运质子，形成跨膜质子动力（20,21）。然而，Chloroflexus aurantiacus与FAP门的其他成员一样，既没有生化证据，也没有基因组证据表明存在相关的细胞色素bc₁或b₆f复合物。缺乏细胞色素bc₁或b₆f复合物表明，这组生物含有一种不寻常的光合电子转移途径。

Yanyushin（22）从Chloroflexus aurantiacus中分离到一种含有c型细胞色素但无细胞色素bc₁复合物特征的多亚基蛋白复合物。来自Rhodothermus marinus的类似复合物现在被命名为替代复合物III(ACIII)（23,24）。这两种复合物已被认为是细胞色素bc₁复合物的功能替代物，这是基于对各种物种（25）的测序基因组的基因分析和对Rhodothermus marinus（23）的ACIII的酶学研究。最近的酶动学分析表明，ACIII发挥了甲萘酚：金花青素氧化还原酶的功能，有力地支持了ACIII在Chloroflexus aurantiacus（26）光合电子转移链中发挥细胞色素bc₁复合物功能作用的假设。图1显示了Chloroflexus aurantiacus中所提出的循环电子转移途径。

根据ACIII基因的基因组排列和早期的基础结构研究，ACIII的组织与细胞色素bc₁或b₆f复合物完全不同。然而，一个具有挑战性的问题出现了：ACIII，一个结构与细胞色素bc复合物大不相同的复合物，如何在光合作用中的电子转移途径中发挥相同的功能？关于ACIII的结构和作用的完整图片仍然缺失。 因此，认为阐明这一系统的关键在于理解ACIII的子结构，以及这与它在光合作用和呼吸中的功能之间的关系。在此基础上，结合MALDI-TOF质谱，提出了光合ACIII的结构示意图。通过凝胶电泳测定每个亚基的大小和类型，包括一维和二维SDS-PAGE和Blue Native-PAGE。采用金属分析、高效液相色谱法、ESI-MS和电位滴定法对ACIII中存在的辅助因子的类型和数量进行了研究。

材料和方法

细菌菌株和生长条件。Chloroflexus aurantiacus菌株J-10-fl在55℃的改良培养基中进行厌氧和光合生长，培养时间为72小时。细胞离心12000g，用20mM Tris-HCl缓冲液(pH8.0)(缓冲液A)洗涤，然后储存在-20℃下。在16升发酵罐中的大规模生长通常产生大约80克湿包装的细胞。

全膜隔离。Chloroflexus aurantiacus细胞解冻，悬浮在缓冲液A中，每4m L缓冲液中1g湿细胞浓度。在预冷声纳器(Branson Sonifier450)中，在4℃下在存在DNase和MgCl₂的情况下，对细胞进行超声处理5min。在12000g下离心15min，沉淀未破碎细胞和大碎片。 上清液在200000g下超速离心2h。得到的颗粒，指的是整个膜，被重新悬浮在缓冲液A中，浓度为OD=10在866nm处，并储存在-20℃直到进一步使用。

蛋白质净化。整个膜样品解冻至室温，用还原剂TritonX-100处理，滴加到最终浓度为4%(w/v)。将固体NaCl加入到0.1M的浓度中，在室温下搅拌1h后，在200000g下进行2h的超速离心。收集到的上清液通过0.2mu;m过滤器过滤，上样到50/10(mm/cm)Q Sepharose柱上快速流动，用含有0.25%还原TritonX-100和0.1MNaCl(缓冲液B)的缓冲液A预平衡。用缓冲液B对柱进行大量的洗涤，直到由于溶解的游离BChl c色素而产生的绿色被洗掉。随后，用含较高NaCl浓度(0.4M)和0.25%还原TritonX-100的缓冲液A洗涤柱。蛋白质，包括ACIII、ATP合成酶和富马酸代醌还原酶(MQFR)，被洗脱（27）。洗脱剂用缓冲液A稀释至3倍体积，并上样到75mLQ Sepharose高性能(QSHP)(GE Healthcare))柱上。粗ACIII和其他蛋白质，如mQFR复合物和ATP合成酶复合物，在20个柱体积中以0.1~0.5M的NaCl线性梯度分离。将含有粗ACIII的馏分合并，用缓冲液A稀释，并上样到第三个离子交换柱上 5 mL QSHP。随后，在缓冲液B中的S-300（26厘米70厘米）凝胶过滤柱上进一步纯化浓缩的粗ACIII馏分。最后的纯化步骤使用MonoQ1柱与Bio-RadDuo流动色谱系统进行，以获得纯化的ACIII，供后续实验使用。进一步净化需要进行洗涤剂交换。除洗涤剂改为0.1%十二烷基麦芽苷(DDM)外，洗涤剂交换过程与上述凝胶过滤柱净化步骤相似。

电泳。在纯化的ACIII上进行了TricineSDS-PAGE，如前面（28）所述，在凝胶的分离层和负载缓冲液中加入12.5%的T/3%尿素(8M)，产生明显的条带。采用 Scheuro;agger和von Jagow（29）的方法进行了Blue Native-PAGE凝胶电泳和随后的二维TricineSDS-PAGE。用比色血红素染色法（30）在SDS-PAGE凝胶上检测c型血红素亚基)。对一系列不同浓度的马心细胞色素c样品和纯化的ACIII样品进行SDS-PAGE和随后的血红素染色，然后使用图像处理程序ImageJ（由国立卫生研究院开发)进行强度分析。

肠内蛋白质消化。染色的亚基带被切除，在凝胶中用胰蛋白酶消化，并从凝胶中提取，如前面（31）所述，并进行修改。将切除的蛋白带在50mM水溶液NH₄HCO₃中，用50%乙腈去除并洗涤。然后用10mM二硫苏糖醇在100mM NH₄HCO₃中还原蛋白质处理30min。蛋白质肽中的半胱氨酸被55mM碘乙酰胺在100mM NH₄HCO₃中进一步烷基化处理30min。将40mM NH₄HCO₃中的胰蛋白酶(PromegaTrypsinGold，TPCK处理)加入到凝胶块中，在37℃下进行酶促反应过夜。然后，用1%三氟乙酸在60%乙腈中提取两次肽处理30min。提取的溶液被收集，在一个speed-vac中完全干燥，然后在含有0.1%三氟乙酸的50%乙腈中重新溶解进行分析。

MALDI-TOF分析和数据库搜索。采用MALDITOF分析，通过肽质量指纹图谱来确定蛋白质的同一性。使用ABI4700MALDI-TOF质谱仪（应用生物系统)进行分析。在不锈钢样品板上发现了肽样品和新制备的基质溶液(在50%乙腈、0.1%TFA水溶液中加入10mg/mLR-氰-4-羟基肉桂酸)约0.5mL的混合物。每个质谱是至少100个激光镜头的平均值，并使用数据资源管理器（应用生物系统)进行校准。 利用MASCOT肽质量指纹数据库搜索软件(www. matrixscience.com)对国家生物技术信息中心序列(NCBInr)数据库进行肽质量值搜索。半胱氨酸的烷基化被认为是一种可能的修饰。考虑了一个缺失的胰蛋白酶切割，并将单视肽块的质量耐受性设置为(plusmn;0.6 Da）。

金属和辅因子分析。用双辛酸蛋白法(BCA法)(Pierce)测定ACIII的浓度。用AA600原子吸收分光度计(PerkinElmer Life Sciences, Wellesley, MA)测定了金属原子的数量和类型。 用吡啶半色素分析对c型血红素（32）的消光系数为23.97mM^-1cm^-1，对血红素量进行了定量。用改性亚甲基蓝法（33）测定酸性不稳定硫的含量。

HPLC法和电喷雾电离质谱法测定血红素含量。在Agilent1100系列HPLC系统上对ACIII中含有血红素的亚基进行了分离。将分离的ACIII(10mg/mL，10mu;L)以1.0mL/min的速率应用于C4反相高效液相色谱柱。流动相为0.1%TFA(溶剂A)和80%乙腈，20%水含0.09%TFA(溶剂B)。在1.0mL/min的流量下施加以下梯度：线性梯度从20%到60%B超过30min，线性梯度从60%到100%B超过50min，100%B超过10min，线性梯度从100%到20%B超过5min，总共95min，然后用20%B的等度洗脱至少30min

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