在酒精性股骨头坏死中减少骨髓间充质干细胞的成骨分化外文翻译资料

在酒精性股骨头坏死中减少骨髓间充质干细胞的成骨分化

原文作者：Suh KT, Kim SW, Roh HL, et al.

单位：CLINICAL ORTHOPAEDICS AND RELATED RESEARC

摘要：我们推测，在酒精性股骨头坏死的病人中从骨中分离出来的成骨细胞和脂肪细胞分化为骨髓间充质干细胞的能力是可以改变。为了验证这一假说，我们研究了酒精性股骨头坏死的病人在髋关节置换术中股骨近端的骨髓中分离出来的骨髓间充质干细胞的分化能力并和股骨颈骨折的病人进行比较。马罗收集了33例髋关节置换术中治疗股骨近端的病人，其中有酒精性股骨头坏死，也有股骨颈骨折。接着对来自骨髓的骨髓间充质干细胞进行分离和大量培养。并对这个细胞群的倍增时间和成骨细胞与脂肪细胞的分化能力进行了比较。发现了从酒精性股骨头坏死的病人中获得的细胞分化为成骨细胞的能力与股骨颈骨折患者的细胞分化为成骨细胞的能力相比，显著降低。这样的一种变化也许在酒精性股骨头坏死的发病过程中起到重要作用。骨髓间充质干细胞的功能改变也许对股骨头坏死的发病机制具有重要作用。

股骨头坏死是一种痛苦的疾病，在晚期阶段经常导致股骨头塌陷。在中晚期，股骨头塌陷的最终治疗选择是全髋关节置换术。虽然病因包括了酒精滥用、类固醇的使用、自身免疫性疾病、创伤、镰刀细胞性贫血和一些特发性表现，但是病因和疾病机理仍不清楚。据报道，有10---74%的病人是滥用酒精引起的非创伤性股骨头坏死。在类固醇和酒精引起的股骨头坏死的病理改变是非常相似的。

据说，股骨头坏死也许是一种骨髓间充质干细胞的疾病。从人的骨髓中分离出来的骨髓间充质干细胞可以分为许多结缔组织，包括骨、软骨和脂肪组织。这些细胞也许在软骨与骨平衡中发挥重要作用，并有助于受伤后的组织再生。例如，在骨折的情况下，用糖皮质激素诱导股骨近端的股骨头坏死的患者，骨髓间充质干细胞会大量减少。除此之外，股骨头坏死的患者的股骨近端的成骨细胞有复制能力异常的现象，但股骨头坏死的患者和骨关节炎患者在碱性磷酸酶的统计指标上和成骨细胞的胶原合成上没有差异。

我们知道，有关成骨和在酒精性股骨头坏死的病人中骨髓间充质干细胞成脂分化能力的文献是非常少的。我们推测，在酒精性股骨头坏死的病人中从骨中分离出来的成骨细胞和脂肪细胞分化为骨髓间充质干细胞的能力是可以改变。为了验证这一假说，我们研究了酒精性股骨头坏死的病人在髋关节置换术中股骨近端的骨髓中分离出来的骨髓间充质干细胞的分化能力并和股骨颈骨折的病人进行比较。

材料与研究方法

在获得患者书面知情同意以后，取得了在髋关节置换术中来自股骨近端的股骨扩髓腔中的骨髓样本（3---5ml）。33名患者被分为2组，一组是有股骨颈骨折二没有用过酒精的病人，有10名40岁到82岁的女性（平均年龄73岁）和8名57到77岁的男性（平均年龄66岁）。另一组的患者是酒精性股骨头坏死的病人，有1名44岁女性和14名40到67岁的男性（平均年龄50岁）。对于酒精性股骨头坏死的成年人，酒精的阈值需要100%的乙醇150L；相当于每周消费400ml的无水乙醇。每周的酒精消费量可以通过计算1周内消耗的每一种饮料的乙醇含量来定义，在所有的酒精性股骨头坏死的病人中，每周这个酒精消耗量要大于400ml，总消耗量要大于150L。并且需要保证所有的患者均没有并发病，也没有接受任何可能影响骨代谢的药物。

骨髓间充质干细胞通过Ficoll-泛影钠密度梯度（每立方厘米密度1.077克；路易斯，莫）分离出单个核细胞，并在alpha;改良的含有20%的胎牛血清培养基中悬浮培养，接种浓度为每平方厘米1*10^6个细胞，在37℃且含有5%的二氧化碳的潮湿环境中培养。在培养5到7天后成纤维细胞克隆出现，来自股骨头骨髓间充质有核细胞换成平板培养。来源于患者的骨髓间充质干细胞在原代培养形成的克隆是有特征的，呈梭形。当粘附细胞数量到达80%时候，细胞用胰蛋白酶消化（0.25%的胰蛋白酶；标准差），接种于alpha;改良的含有20%的胎牛血清，细胞浓度在每平方厘米1*10^3个细胞。细胞通过继代培养进行体外扩增，并为接下来的实验所使用。

对细胞表面标志物的表达进行检测，细胞用4%的多聚甲醛固定10分钟，用0.1% Triton X-100渗透10分钟。配置稀释溶液，由磷酸盐生理盐水缓冲液、1%的牛血清白蛋白（标准差）和从类似的物种中提出的1%的血清（标准差）抗体组成。接下来这个过程限制在30分钟内，每30分钟与抗体进行孵育，针对CD29-PE（1:100），CD44-FITC（1:100），CD133（1:100），CD34（1:100），或CD14（1:100），荧光素或藻红蛋白的抗鼠和抗小鼠免疫球蛋白。每一步都要用磷酸盐缓冲盐溶液加0.3%的牛血清蛋白冲洗。

第三步可以收获90%的骨髓间充质干细胞，在平板培养后细胞数目的倍增时期可以被确定（一个12孔板每平方厘米1*10^3个细胞）。

平板培养一定数量的细胞以后转移到12孔板，骨髓间充质干细胞在融合状态下生长。我们找不到任何组（数据未显示）的细胞大小的差异。然后，通过培养骨髓间充质干细胞2周，在分化培养基（含10%胎牛血清、1 mol/L地塞米松，100克/毫升3-异丁基-1-甲基黄嘌呤，5 g／ml胰岛素和60 mol/L吲哚美辛---MEM）中进行成脂分化诱导，使用油红O（标准差）染色为细胞内脂质积聚指标。细胞固定于4%中性缓冲甲醛中10分钟，然后用水加入3%异丙醇洗，然后用新过滤过的油红O染色溶液在常温下孵育1小时。染色后，细胞用双蒸馏水冲洗。为了获得定量数据，加入1毫升异丙醇于染色培养皿中。测量油红染色光学密度为405纳米。

平板培养一定数量的细胞以后转移到12孔板，在成骨培养基（10%胎牛血清，0.1 mol/L地塞米松，10 mol/L甘油，和50克/毫升抗坏血酸---MEM）中成骨分化可以通过2周时间培养融合状态的骨髓间充质干细胞来诱导，细胞外基质钙化水平可以通过茜素红氏染色来检测。成骨分化的量化可以通过图像分析程序（Meta Morph, Universal Imaging, Downingtown,PA）来测定被茜素红S染色的染色区。在每个实验中重复测量，实验重复3至4次。为了测定碱性磷酸酶的活性，用Tris缓冲生理盐水（50 mmol/L Tris和150 mmol/L氯化钠（PH值为7.4））来洗涤细胞两次，用刮刀切下平板，用声波降解法降解细胞，用10 mol/L p---硝基苯磷酸盐作为培养基，细胞裂解液在含0.1 mol/L 2---氨基---2---甲基---1,3---丙二醇和5 mmol/L 氯化镁（pH值10）,37℃反应1小时。碱性磷酸酶的活性表示每摩尔每分钟每毫克蛋白质p---硝基苯酚反应。蛋白质的含量可以用以牛血清白蛋白为标准的蛋白质分析试剂盒（(Bio-Rad, Hercules, CA）来确定。

非参数检验被用于统计分析，是因为大多数变量通常不标准性分布。用曼－惠特尼秩和检验法找寻组与组之间的差异。变量之间的关系用线性回归分析法测定。结果是表示为平均值

plusmn;标准差的平均值。A p值lt; 0.05被认为是有意义的。

结果

骨髓间充质干细胞表面标记物的表达用免疫细胞化学法测定，免疫细胞化学法是在未分化状态时用单克隆抗体CD29-PE，CD44-FITC，CD34，CD14，和CD133测定。骨髓间充质干细胞表达CD29-PE和CD44-FITC，MSC标记（图1），但不表达CD34、CD14、CD133、造血细胞标志物。

细胞分化成脂肪细胞和成骨细胞谱系，使用谱系特异性诱导因子研究骨髓间充质干细胞的多向分化能力。为了确定骨髓间充质干细胞是否转变为脂肪细胞，我们需要对在分化培养基上培养的细胞用油红O染色。细胞内大部分（约80%）含有大量的用油红O染色的细胞内脂滴（图2A）。在未分化的骨髓间充质干细胞内发现无脂滴（图2B）。

我们对用茜素红染色的骨髓间充质干细胞细胞外基质的钙化程度进行了评估，我们发现

在单层细胞中钙化呈红色区域。与成骨相一致，几个红色区域表示在成骨培养基上培养的骨髓间充质干细胞治疗2周时，细胞外基质钙化（图2C）。在未分化的骨髓间充质干细胞中无发现钙化（图2D）。骨髓间充质干细胞的分化潜力至少保持在15倍的增长。

股骨颈骨折患者的年龄大约在40---82岁之间。因此，我们要检测是否患者的年龄可以改变骨髓间充质干细胞的倍增时间。来源于股骨颈骨折患者的骨髓间充质干细胞，在培养基中的倍增时间并没有与他们的年龄有关（图3）。我们对患有股骨颈骨折的患者进行了检查，来确定是否细胞分化成骨细胞的能力和脂肪细胞的途径与年龄有关。在骨髓间充质干细胞中碱性磷酸酶活性和脂质沉积量与年龄没有相关性（图4）。

酒精性股骨头坏死病人的骨髓间充质干细胞的倍增时间少于(p lt; 0.001)股骨颈骨折患者的骨髓间充质干细胞的倍增时间（表1）。

酒精性股骨头坏死病人的成脂分化与股骨颈骨折患者的成脂分化大致相似（表1）。

我们对酒精性股骨头坏死病人和股骨颈骨折患者的成骨分化能力进行比较，发现酒精性股骨头坏死病人的成骨分化能力明显减少(p lt; 0.001) （表1）。

讨论

我们的研究结果显示，酒精性股骨头坏死患者与股骨颈骨折患者相比，酒精性股骨头坏死患者获得的骨髓间充质干细胞能够降低成骨分化能力和细胞倍增时间。

在目前的研究中，股骨颈骨折的患者被用作对照组。我们应该把年龄和性别匹配起来，但是这是非常困难的，因为这既有伦理问题也有特征年龄与性别分布问题。一些研究人员发现，骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化的潜能在不停的降低。然而，另一些人提供证据证明骨髓间充质干细胞发育成成骨细胞的潜能呈年龄相关性而下降。我们没有找到任何关于骨髓间充质干细胞发育成成骨细胞的潜能与年龄增大的报道。我们的研究结果表明，在当前培养条件下，从股骨颈骨折患者中分离的骨髓间充质干细胞的增殖和多向分化的潜能并没有随着病人的年龄而改变。这些差异的原因还不明确，但它可能是由于实验中方法不当、患者的选择和骨髓取样部位造成的差异。来源于酒精性股骨头坏死患者的细胞比股骨颈骨折患者的细胞有更少的成骨的分化。酒精性股骨头坏死病人的平均年龄比股骨颈骨折病人的平均年龄更年轻这是事实。在目前的研究中，患者性别比例可能是一个问题。这个比例的不同可能因为疾病的性别分布不同。在2篇文章中，我们可以找到男女不同的骨髓间充质干细胞。女性的碱性磷酸酯酶阳性克隆的比率比男性低。但是，没有任何报告显示女性的碱性磷酸酶阳性克隆比男性多而患病率增加。尽管有许多的女性在股骨颈骨折组而不在酒精性股骨头坏死组，但是酒精性股骨头坏死患者的细胞与股骨颈骨折患者的细胞相比，成骨分化能力更低。

酒精性股骨头坏死病人的股骨头与股骨颈骨折病人的股骨头有2个方面的不同；他们具有更小的增殖能力，他们在成骨分化中并不是那么活跃。酒精可以诱导骨髓间充质干细胞向脂肪细胞分化。骨髓间充质干细胞用乙醇治疗也表现为碱性磷酸酶和骨钙蛋白的活性和表达减弱。在酒精性股骨头坏死的病人的髂嵴的骨髓中，骨髓间充质干细胞的数目有明显降低。我们发现在体外，酒精慢性摄入的患者的骨髓间充质干细胞，在酒精减少的情形下，成骨分化潜能明显降低。这种变化可能对于酒精性股骨头坏死的发展起到一定的作用。骨髓间充质干细胞的功能改变骨坏死的发病机制有一定作用。在早期，是有足够的修复能力是病变部位痊愈的。在骨形成过程中，修复能力不足的机制可能可以进一步解释骨坏死的演化阶段。骨形成的速度在很大程度上取决于祖细胞复制率。

在我们的研究中，取自酒精性股骨头坏死患者股骨头的骨髓间充质细胞对脂肪细胞的分化能力已经被检测。结果表明，在骨髓中，虽然酒精可以增加脂肪生成率，但是酒精性股骨头坏死患者股骨头的骨髓间充质细胞的成脂分化能力很弱。

髋关节置换术中的股骨骨髓包含多潜能干细胞，并且可以减少酒精性股骨头坏死患者的骨髓间充质干细胞的成骨分化能力。这种变化可能对于酒精性股骨头坏死的发展起到一定的作用。骨髓间充质干细胞的功能改变对股骨头坏死的发病机制具有重要作用。然而，我们并没有确定慢性酒精中毒是如何让骨髓间充质干细胞对成骨细胞分化产生影响的。慢性酒精摄入

可以通过改变干细胞来改变骨髓间充质干细胞的分化潜能。另一种可能是根据骨髓间充质干细胞的分化潜能，敏感性的酒精性股骨头坏死变化的结果。

外文文献出处：http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/15685079

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