识别印迹基因受父母起源特异表达的拟南芥种子外文翻译资料

识别印迹基因受父母起源特异表达的拟南芥种子

摘要

背景资料: 一些常染色体基因的基因组印记基因剂量的表观遗传调控有利于在哺乳动物和开花植物的正常生殖发育。虽然许多印记基因已经确定，并深入研究在哺乳动物中，较小的数字已经在开花植物，主要是在拟南芥中的特点。在开花植物的全基因组筛选种子中特异表达的组织起源的单亲家长更多的印迹位点的识别将有助于我们在开花植物印迹基因的起源和作用的认识。

结果: cDNA AFLP可以检测等位基因特异表达，是产生依赖表达的基因，酶切位点多态性存在于来自各等位基因的转录本的父母。使用全基因组cdnaaflp屏幕测量等位基因特异性表达4500转录衍生片段，我们报告的鉴定52母系表达基因（Meg）显示母源依赖性表达模式在拟南芥角果含F1杂交种子（3，4和5授粉后天数）。我们确定这些megs的开发生物信息学工具genfrag直接确定身份的转录衍生片段（I）它们的大小和（ii），选择性核苷酸加入引物用于生成它们。因此，genfrag全基因组cDNA AFLP片段有利于增加吞吐量分析。52那时，我们确定了进一步筛选胚乳中的相对高的表达水平，以确定候选基因最有可能代表新的印记基因在拟南芥胚乳中表达。

在前三位的种子排名候选基因的组织表达，atcdc48，pde120和MS5一样，是通过激光捕获显微切割和qRT-PCR分析证实。这些基因在拟南芥种子特异性表达的F1母确认通过等位基因特异的转录分析在一系列不同的品种。差异甲基化区域的确定相邻atcdc48和pde120，这可能代表候选印记控制区。最后，我们表明，这三个基因在营养组织中的表达水平

是MET1依赖，而在种子的单亲母亲的表达不依赖MET1。

结论：利用cDNA AFLP转录谱的方法，我们已经确定了三个基因，atcdc48，pde120和MS5像代表在拟南芥种子的印迹基因表达的母系小说。为我们的cDNA AFLP屏幕之间的重叠程度的母系表达的印记基因，和其他屏幕的印迹和胚乳基因表达分析。

背景: 开花植物（被子植物）的种子是嵌合结构包含组织的细胞基因组的贡献不平等从父系和母系。拟南芥种子的二倍体胚胎是由含有核基因组的细胞，从母亲和父亲的父母继承了同样的。相比之下，三倍体的胚乳含有两个母系遗传的核基因组和父系基因组。此外，这两个受精的产品被来自母体的二倍体种皮[ 4 ]。三倍体的胚乳是终末分化的结构，滋养胚胎发育，而母体种皮中起着关键的作用，支持种子的发育和胚胎这港口[ 5 ]。的相互作用，这些不同组织之间的基因组在种子发育过程中植物仍然知之甚少[6,7]，尽管被子植物种子的基本经济的重要性。对于任何给定的基因，每个种子组织的相对和绝对贡献的整体转录水平在种子，很难确定。

对男性和女性的基因组嵌合的种子是种子发育可以通过基因组剂量和原产地效应[ 6,8,9 ]影响不平等的贡献的一个重要结果。这样的母体效应，包括从母体获得的种子和孢子体的母体效应，配子母体效应来自雌配子。在种子发育的配子母体效应可能是由于（a）在胚乳总剂量效应；（b）对母系沉积表示在受精卵和中央细胞，引起的分别为胚和胚乳；（c）通过基因组印记基因的表观遗传调控基因的表达，其中常染色体显性遗传uniparentally受精后在亲本来源的具体方式[9,10]。

基因组印记主要描述在哺乳动物和开花植物，它发生在营养组织（胚乳，胎盘）和

发育中的胚胎，虽然后者是罕见的植物[ 11 ]。虽然有许多关于哺乳动物和植物基因组印记进化的理论，由于“父母冲突的资源”所产生的一些重点配置[12,13]或由于必要的早期发展[14,15]中关键基因的基因剂量限制。

许多印记基因（即数百，通常安排在沿染色体的基因簇）已经确定，并在哺乳动物中深入研究物种[ 16 ]。直到最近（2010），只有18个印迹基因曾被报道在所有的开花植物，其中11在拟南芥（附加文件1表一）。印迹基因已使用不同的策略，包括：突变体的筛选母系控制种子败育（拟南芥MEA和FIS2 [ 17 ]）；筛选基因的调控通过FIS多梳复合（拟南芥PHE1 [ 18 ]）；微阵列分析寻找基因具有类似的反应，已知的印迹基因（拟南芥MPC [ 19 ]）；胚乳基因分析（玉米蛋白[ 20 ]），并结合微阵列分析和等位基因特异表达从相互交叉的自交系胚乳分析（八的玉米基因[ 21 ]）。利用受精种子CDKA；1缺乏父系基因组的贡献到（未受精的）中央细胞，shirzadi等人（2011）用基因芯片技术来识别agl36为母系表达的印记基因中600个基因，在一个父亲的基因组的情况下，差异调节[ 22 ]。新一代测序技术的出现为基础的转录促进了额外的印迹基因的候选人最近在拟南芥种子鉴定方法[23,24]。Hsieh等人（2011）[ 24 ] 43确认鉴定印记基因（9 paternallyexpressed母系表达，34）在F1杂交种子（授粉后7-8天）从正反times;Col-0 Ler的-0。再次使用下一代测序方法，沃尔夫等人（2011）[ 23 ]已经确定65个候选印记基因在F1杂交种子（授粉后4天）从bur-0times;Col-0正反交的19个被证实是横向（8paternally表示，和11个母系表达）。因此，“下一代测序研究现在被用来确定假定印迹基因[ 23,24 ]。

为确定新的印迹基因间接方法是基于差异甲基化区域（DMRS）作为识别研究候选印记控制区（ICR）[ 25 ]。作为改性剂的基因组印迹也被发现在植物和包括MET1 [ 26 ]，DDM1 [ 17 ] - [ 27 ]。例如，5-甲基胞嘧啶DNA糖基化酶基因DME是优先表达在中央细胞的雌配子体，可以通过去甲基化ICRS [ 27 ]调节胚乳中的一些印记基因的表达。在突变体胚乳ICRS保持DME甲基化，因此有些印迹基因的调控，这有利于他们的检测[ 27 ]。

印迹位点的F1杂交后代的分析。此外，在一个植物种子中检测到特定的母体特异性表达，它是必要的，以区分种皮与胚乳（和/或胚胎）表达，并区分转录母系沉积在蛋和/或中央细胞受精后转录产生与发展中的胚乳和/或胚胎[ 11 ]。虽然印记基因显示清晰突变体的表型（例如Medea）对种子发育可以有助于解释这样的位点为印迹[ 10 ]，许多印迹基因鉴定日期做不显示任何明显的突变表型种子[ 29 ]。在某些情况下，启动子：记者结构已被用来确定cisregulatory区域所需的印迹[ 19,30 ]，而只有一项研究表明受精后初生单亲从头转录的印迹基因在胚乳[ 17 ]。

转录分析平台的选择是新的印记基因鉴定的重要考虑因素。微阵列技术依赖于基因

被表达在一个水平足以被检测通过杂交和互补的策略是必要的，也可以检测印迹基因，可能是低表达。因此，在本研究中我们选择了cDNA AFLP [ 31 ]全基因组筛选新的印记基因。虽然早期生成的转录谱技术，作为一种基于PCR的cDNA AFLP技术，允许即使是低表达基因扩增和可以识别uniparentally表示所有的情况下，有父母的等位基因之间的限制性位点多态性基因。为了促进全基因组cDNA AFLP表达谱，我们已经开发出一种基因识别的生物信息学软件程序，genfrag，可以确定基因显示来源特异性cDNA AFLP表达家长的身份。

我们的分析，在基于互惠F1杂种种子生成的实验设计等位基因特异表达4500转录衍生片段（个TDFs）允许显示产妇特异性表达（Meg）52个基因的鉴定。一些这些兆母体的特异表达可能是由于基因组印记。在这52个母系表达基因，18代表基因显示较高的相对和绝对的表达水平在胚乳相对于母体种皮。因此，检测对F1杂交种子在授粉后4天的产妇等基因的特异表达基因（DAP）是受在胚乳发育基因组印迹一致。这18个M四近端的差异甲基化区域（DMRS）在野生型和突变的背景，可能代表候选人DME控制单元的铭印种子胚乳（ICRS）。在排名前三的考生（atcdc48，pde120和MS5像）我们确认在F1杂交种子4天产妇的具体表达和描述它们的等位基因特异表达的控制在不同的发育阶段，在不同的遗传和突变的背景。总的来说，我们已经确定了一系列的拟南芥种子新兆，由此进一步证明拟南芥种子的印迹基因表达的母系小说。

结果

拟南芥角果含F1杂交种子cDNA AFLP分析检测93个TDFs单性生殖表达

确定单性生殖表示在F1杂交种子在拟南芥全基因组cDNA AFLP角果采用基因转录谱的方法。在3，4和5天，RNA样品从角果含F1杂交种子通过加入Col-0和Ler的-0相互间杂交产生的。这三个阶段对应的发展阶段从晚球形（3天）的早期和晚期的心脏阶段（4和5天）内的种子胚的发育。这些阶段的胚胎发育进行减轻对卵细胞和/或中央细胞检测母体沉积的长寿的RNA的可能性，也因为合子表达从两个亲本的等位基因是显然的在这发育阶段[ 32 ]。在这些样品中，母系表达基因可能从角果或F1种子组织检测，和的F1种子内从母体种皮或受精产品（即胚胎和/或胚乳）。

AFLP是cDNA来自RNA样品的限制性内切酶酶切后经常进行（BstYI和稀有切割酶）（进行）（附加文件2图S1）。片段分别连接到酶的酶切位点互补的适配器。减少碎片的混合物的复杂性，进行生成使用选择性引物片段亚群进行了一系列的PCR扩增。这些选择性引物共享一个共同的序列，对应的适配器和一部分酶切位点，但分化的一个或两个额外的核苷酸在3，calledselective核苷酸（方法；附加文件2 ）。

该cDNA AFLP生成的转录片段（个TDFs）运行在一个abi3130xl毛细管分析和可视化与荧光标记的探针准确估计自己的尺寸（见方法）。检测到三个时间点共10200个（3，4，5天）。对大小不等，从50到500碱基对（bp），平均每80 bp的可视化示例。的10200个TDFs筛选cDNA，4500显示来自不同品种之间的杂交之间的多态性（遗传背景）的尺寸范围从100个基点至500基点。母系表达的等位基因在大致相等的数字时，每两个发现份作为正反母体（附加文件3表S2）。例如，在4天的时间点，366个母系表达型在times;交叉检测等位基因型Ler的-0，而在倒数times;交叉检测306 Ler的-0型母系等位基因表达Ler的-0。母系表达对检测到的三个发展阶段表明早期母体的特异性转录角果一致是相似的发展。每个多态性等位基因（即Col-0 VS Ler的-0等位基因不同的限制性位点），只有1个片段是从每一个限制性内切酶事件检测只有那些个TDFs poly-A尾近端进行分离分析。因此，每两份内有个检测各时间点的数量没有冗余。

识别单性生殖表达基因，cDNA AFLP图谱这些4500多态个TDFs进行比较得到的那些从角果含互惠F1杂交种子（即F1后代Ler的-0times;Col-0与Col-0times;Ler的-0十字架）得到的那些相同的加入（即Col-0times;Col-0，Ler的-0times;Ler的-0）植物之间的等效交叉。样品在3，4和5天进行过滤显示单亲表达TDFs至少两阶段抽样。这种策略允许93条单性生殖表达鉴定。所有93的单性生殖表达的TDFs显示母亲的特异表达模式（附加文件4台S3）。

基于TDF的大小和使用GenFrag生物信息学程序每对引物选择性核苷酸直接基因的鉴定

确定拟南芥角果产生含有F1杂交种子检测母体TDFs基因（附加文件4台S3），我们开发了一个生物信息学程序称为GenFrag。GenFrag是设计允许在硅片的个TDFs cDNA AFLP使用公开可用的cDNA和EST库（的注释拟南芥基因组中还包括所有策划的剪接变异体[ 33 ]）产生的序列的识别。利用这些资源，GenFrag设计模拟的cdnaaflp步骤电子通过双酶切位点扫描现有的拟南芥基因组信息（见方法和附加文件2图S1）。给定的片段大小（如评估的毛细管测序）和选择性核苷酸添加使用的引物产生的TDF，GenFrag可以识别的相应序列的TDF，从而相应基因TDF的身份。GenFrag软件开发的开源软件，可以免费在线使用。

http://www.nem.wur.nl/UK/Research/bio/

基于GenFrag从93组52个母系表达基因的鉴定

GenFrag是用来识别基因对应的93个产妇具体（附加文件4table S3）。为了提高选择性，我们成立了一个期权创片段仅返回最后一个匹配的片段在5“- 3”序列最接近的mRNA polyA尾片段。我们结合这一严格的适应范围为1 bp的偏差所观察到的大小的TDF在毛细管分析仪和大小在硅片预测一个候选序列运行时。利用这些条件，GenFrag能够确定唯一的序列（即ID）为52的93个母系表达比赛对确定的（即在4 tables3 1-52个附加文件）。剩余的个TDFs，21匹配共享一个以上的基因序列，因此不能被唯一区分（个TDFs 53-73附加文件表4 S3），而其余20不能被匹配任何基因使用GenFrag方法（个TDFs 74-93段附加文件表4 S3）。鉴定这20个TDFs的缺乏可能是由于异常的限制性内切酶和/或不完全覆盖拟南芥转录。52独特的序列个TDFs匹配基因的BLAST搜索拟南芥基因组（TAIR V.8）。这使我们能够明确地识别52拟南芥角果含F1杂交种子基因母系表达（表1）。这52个母系表达基因的GO富集分析没有发现任何显着富集的条件（数据未显示）。我们的52集兆不包括已知的印迹基因与拟南芥，然而，这是不足为奇的，因为大多数这些52 megs有几个SNP之间的差异等位基因从不同品种，在那里他们做，SNPs不破坏的限制性酶切位点扫描的cDNA AFLP技术使用这些限制性内切酶（附加文件表5 S4）。例如，在母系表达的印记基因的编码序列没有Col-0 / Ler的-0单核苷酸多态性美狄亚。52基因识别代表新的母系表

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